血管紧张素Ⅱ对成骨细胞IL-6表达的影响*

徐良志，张 晨

1)核工业四一七医院骨科 临潼 710600 2)西安交通大学医学院第二附属医院骨一科 西安 710004

近年研究[1]发现，骨组织存在局部的肾素-血管紧张素系统，而且对骨骼的生长、发育及代谢发挥着重要的调控作用。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是肾素-血管紧张素系统的主要效应肽，具有重要的生理功能。骨组织局部肾素-血管紧张素系统对骨代谢的调节主要表现在AngⅡ促进成骨细胞分泌细胞因子，进而促进破骨细胞的形成和活化，其中破骨细胞分化因子(RANKL)便是其中之一[2-3]。白细胞介素-6(IL-6)同样可以促进破骨细胞的形成和活化，在骨代谢中发挥重要作用[4]。但是AngⅡ是否能促进成骨细胞IL-6的表达以及作用机制还不明确。以前的研究[5]表明，细胞内活性氧和NF-κB信号通路在调节IL-6的表达中发挥了非常重要的作用。而在其他研究[6-7]中发现AngⅡ可以增加细胞内活性氧以及激活NF-κB信号通路。为此，作者利用小鼠成骨样细胞株MC3T3-E1来研究AngⅡ是否能促进成骨细胞表达IL-6以及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 小鼠成骨样细胞株MC3T3-E1购自上海生命科学研究院细胞资源中心，α-MEM培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素双抗、Trizol试剂盒均购自美国Gibco公司，AngⅡ、奥美沙坦(olmsartan，Olm)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetyleysteine，NAC)，2'，7'-二氯荧光黄二乙酸酯(DCFH-DA)、吡咯烷二硫代甲酸铵盐(PDTC)均购自美国Sigma公司，兔抗小鼠NF-κB p65抗体和磷酸化p65(p-p65)抗体均购自美国Abcam公司，HRP标记羊抗兔二抗购自美国Santa Cruz公司，逆转录试剂盒购自加拿大Fermentas公司，IL-6 ELISA试剂盒购自美国R＆D公司，PCR扩增仪购自美国Bio-Rad公司，RIPA裂解液购自美国Thermo Scientific公司，增强型ECL化学发光检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、预染蛋白质分子量标准购自碧云天生物技术研究所，垂直板电泳仪购自北京六一厂，转移电泳槽购自美国伯乐公司，荧光显微镜数码照相系统购自日本Nikon公司。

1.2 细胞培养及分组 先将MC3T3-E1细胞复苏，用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基37℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养。每2 d更换一次培养液，待细胞长满后传代。取对数生长期的细胞进行以下实验。用无血清培养基培养12 h后，调整细胞密度为5×106mL－1，然后分为5组:对照组(用无血清培养基培养)、AngⅡ处理组[给予AngⅡ处理24 h(预实验结果显示AngⅡ对成骨细胞IL-6 mRNA的促进作用随着其浓度的增加而增加，故选用10－6mol/L AngⅡ对细胞进行干预)]、AngⅡⅠ型受体阻滞剂Olm+AngⅡ处理组(10－5mol/L Olm预孵育1 h，再给予10－6mol/L AngⅡ处理24 h)、氧自由基清除剂 NAC+AngⅡ处理组(10－3mol/L NAC预孵育1 h，再给予10－6mol/L AngⅡ处理24 h)、NF-κB信号通路阻滞剂PDTC+AngⅡ处理组(10－4mol/L PDTC 预孵育 1 h，再给予 10－6mol/L AngⅡ处理24 h)。每组均设5个平行对照。

1.3 各组细胞中IL-6 mRNA的RT-PCR检测细胞给予不同干预(实验分组同1.2)后，用Trizol试剂盒提取细胞内总RNA，然后反转录成cDNA。用PCR Mix试剂和PCR扩增仪按照说明书步骤及要求进行扩增后，取扩增产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶图像分析系统进行分析，以目的基因条带与GAPDH条带灰度值的比值表示mRNA的相对表达量。IL-6上游引物序列5'-ACAAAGCCA GAGTCCTTCAGAG-3'，下游引物序列 5'-CCTTAGC CACTCCTTCTGTGACT-3'，扩增产物大小为378 bp;GAPDH上游引物序列5'-ACCACAGTCCATGCCAT CAC-3'，下游引物序列5'-TCCACCACCCTGTTGCTG TA-3'，扩增产物大小为486 bp。

1.4 各组细胞上清液中IL-6含量的ELISA测定细胞给予不同干预(实验分组同1.2)后，取上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行操作。在450 nm的波长下测定样本的吸光度值，然后根据标准曲线计算细胞上清液中IL-6的含量(ng/L)。

1.5 各组细胞内活性氧的测定 细胞给予不同干预(实验分组同1.2)后，去除细胞培养液，加入稀释好的DCFH-DA(用无血清培养液稀释至终浓度为10－5mol/L)，加入的体积以能充分盖住细胞为宜，在细胞培养箱内培养30 min，用无血清培养液洗涤细胞3次，然后在荧光显微镜下采集图像信息，每组采集2个视野，最后利用Image Pro Plus 4.5图像分析软件进行荧光值分析。

1.6 各组细胞中 p65和 p-p65表达的 Western blot检测 用细胞裂解液提取各组细胞内总蛋白，然后加入上样缓冲液，煮沸，10 min变性。上样量为15 μL/孔，然后进行凝胶电泳、转膜。转膜后，50 g/L脱脂牛奶室温封闭2 h，然后加入兔抗小鼠p65和p-p65单克隆抗体4℃过夜。然后加入HRP标记的山羊抗兔二抗室温孵育2 h。最后在暗室中加ECL显影，选β-actin作为内参对目的蛋白进行对比分析。采用Image Pro Plus 4.5图像分析软件进行图像的灰度定量分析。

1.7 各组细胞中p65核内移的免疫荧光检测 为了进一步验证NF-κB信号通路的被激活情况，利用细胞免疫荧光技术，观察p65蛋白的核内移情况。调整细胞密度为5×106mL－1，然后按实验目的给予各组细胞不同干预(实验分组同1.2)。40 g/L中性多聚甲醛固定，用2.5 g/L的 Triton X-100透膜，BSA封闭，然后加入兔抗小鼠p65一抗4℃过夜，荧光二抗在37℃下孵育2 h，DAPI染核3 min，最后在荧光显微镜下观察。

1.8 统计学处理 采用SPSS 17.0进行分析，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组细胞中IL-6 mRNA和蛋白、活性氧、p65和p-p65表达的差异，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 各组细胞中IL-6 mRNA和蛋白的表达 见表1。

2.2 各组细胞内活性氧的测定结果 见图1、表2。

表1 各组细胞中IL-6 mRNA和蛋白的表达

图1 各组细胞内活性氧的测定结果(×400)

表2 各组细胞内活性氧、p65和p-p65表达的比较

2.3 各组细胞中p65和p-p65表达的结果 见图2、表2。免疫荧光检测结果表明，AngⅡ可以明显增加p65蛋白在细胞核内的表达，这种现象可以被Olm、NAC以及PDTC所抑制(图3)。

图2 各组细胞中p65和p-p65的表达

图3 各组细胞中p65的细胞内定位(×400)

3 讨论

细胞因子与骨吸收密切相关，并且参与一些疾病的发病过程，如骨质疏松、类风湿性关节炎等[8]。许多细胞因子是由成骨细胞分泌的，可以调节破骨细胞的分化、成熟以及成熟破骨细胞的激活[9]。而IL-6就是由成骨细胞分泌的、可以调节破骨细胞的分化、成熟以及成熟破骨细胞激活的细胞因子，它在骨代谢中发挥重要作用[4，10]。以前的研究[11]表明许多骨吸收因子如TNF-α、IL-1以及甲状旁腺激素都可以促进成骨细胞分泌IL-6。

AngⅡ是肾素-血管紧张素系统的主要效应肽[12-13]，它可以调节许多组织的生长、发育、凋亡以及炎症反应[14-16]。研究[5]发现 AngⅡ可以促进血管平滑肌细胞以及单核细胞分泌IL-6和MCP-1，并且AngⅡⅠ型受体阻滞剂可以明显降低慢性心力衰竭患者血清IL-6水平[17]，表明IL-6很可能是AngⅡ发挥生理效应的中间介质。

该研究发现，AngⅡ可以明显促进成骨细胞IL-6的表达，但这种作用可以被其Ⅰ型受体阻滞剂Olm所阻断，同样，氧自由基清除剂NAC以及NF-κB信号通路阻滞剂PDTC可以阻断AngⅡ对成骨细胞IL-6表达的促进作用;AngⅡ可以明显增加成骨细胞内活性氧以及p65的磷酸化水平，并且还可以增加p65蛋白从胞浆到胞核的移动。这些实验结果充分说明了AngⅡⅠ型受体/活性氧/NF-κB信号通路在AngⅡ促进成骨细胞表达IL-6的过程中发挥重要作用。

AngⅡ主要通过Ⅰ型和Ⅱ型受体发挥作用[18]，而作者的研究发现AngⅡ促进成骨细胞IL-6的表达主要通过Ⅰ型受体起作用。研究[6-7]表明，AngⅡ可以促进心肌细胞、肾小球内皮细胞内活性氧的产生，进而促进一些炎症因子的表达。该研究同样发现活性氧在AngⅡ促进成骨细胞表达IL-6的过程中发挥重要作用。而且，AngⅡ促进细胞内活性氧产生的作用可以被AngⅡⅠ型受体阻断剂以及以自由基清除剂所阻断，而NF-κB信号通路抑制剂对此却没有作用。NF-κB信号通路抑制剂可阻断AngⅡ对成骨细胞IL-6表达的促进作用。而AngⅡ同样可以增加p65的磷酸化水平，这种作用也可以被AngⅡⅠ型受体阻断剂、自由基清除剂和NF-κB信号通路抑制剂所阻断。

综上所述，AngⅡ首先通过AngⅡⅠ型受体促进成骨细胞内活性氧的产生，进而作用于NF-κB信号通路，最后促进成骨细胞高表达IL-6。

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