二氧化铈纳米颗粒对大鼠心肌的保护作用*

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 250～300 g健康成年雄性SD大鼠24只，购于河南省实验动物中心;10～25 nm粒径CeO2纳米颗粒，购于美国Sigma公司，批号554841;SOD、MDA、CAT、LDH、CK－MB 检测试剂盒，购于南京建成生物工程研究所;HX－100E型MS4000小动物呼吸机，购于成都泰盟科技有限公司;VCX500型超声细胞破碎仪，购于美国Sonics公司;DG5031型酶联免疫检测仪，购于华东电子集团医疗装备有限责任公司。

1.2 实验分组将24只大鼠采用随机数字表法分为3组，模型组、假手术组、CeO2纳米颗粒组，每组8只。适应性饲养1周后进行模型的制作。模型组于模型制作前24 h经大鼠尾静脉注射PBS液(2 mL/kg)，然后成功制作心肌缺血再灌注模型;假手术组于术前24 h经尾静脉注射PBS液(2 mL/kg)，左冠状动脉前降支只穿线不结扎;CeO2纳米颗粒组于术前24 h经尾静脉注射CeO2纳米颗粒悬液(2 mL/kg)，模型制作同模型组。

1.3 大鼠心肌缺血再灌注模型制作将大鼠采用腹腔注射体积分数10%水合氯醛的方法麻醉，仰卧位固定并行气管插管，连接小动物呼吸机。呼吸机潮气量设置为30 mL/kg，70次/min，吸呼比2∶1。于胸骨左缘第4、5肋间心脏搏动最明显处切开皮肤，分离组织进入胸腔。撕破心包膜，将心脏充分暴露。在肺动脉圆锥与左心耳之间距离主动脉根部约3 mm处穿线，在线结和心脏表面垫一乳胶管，待大鼠心律规整后结扎左冠状动脉前降支。结扎线远端心肌颜色先变白而后变紫绀为结扎成功，结扎45 min后松解结扎线，再灌注120 min，缺血心肌组织颜色恢复为模型制作成功。

1.4 CeO2纳米颗粒悬液制备将CeO2纳米颗粒溶于PBS液中，使其充分溶解，制成1000 mg/L的纳米悬液。用前在超声细胞破碎仪中振荡2 min，充分混匀，并用0.2 μm针头滤器过滤。

1.5 心肌组织病理学观察和心肌酶学检测再灌注120 min后松解结扎线，处死大鼠并快速取出心脏，取左心室缺血区心肌组织，使用预冷生理盐水冲洗残留血液，滤纸吸干心肌表面水分，将其分为2份，一份置于体积分数10%甲醛溶液中进行固定，制作石蜡切片，行HE染色，光镜下观察心肌组织病理学变化;另一份保存于－80℃冰箱用于SOD、CAT、LDH、CK－MB、MDA 的检测，测定时将心肌组织在低温环境下研磨成心肌组织匀浆，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.6 统计学处理应用SPSS 17.0进行数据分析。各组间 SOD、CAT、LDH、CK－MB、MDA 的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD－t检验。检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 大鼠心肌组织 SOD、CAT、LDH、CK-MB活性和MDA含量测定结果模型组与假手术组比较，心肌组织中 SOD、CAT、LDH、CK－MB 活性降低，MDA含量升高;CeO2纳米颗粒组与模型组比较，SOD、CAT、LDH、CK－MB 活性升高，MDA 含量降低。见表 1、2。

表1 CeO2纳米颗粒对心肌抗氧化酶的影响(n=8)

表2 CeO2纳米颗粒对心肌损伤标志物和脂质过氧化产物的影响(n=8)

2.2 心肌组织病理学观察结果光镜下可见，假手术组心肌细胞排列整齐，细胞膜结构完整，未见炎性细胞浸润现象;模型组可见心肌细胞肿胀、坏死，排列紊乱，伴有炎性细胞浸润;CeO2纳米颗粒组心肌细胞肿胀及坏死程度较模型组明显减轻，炎性细胞浸润减少。见图1。

图1 各组心肌组织HE染色结果(×200)

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤即是缺血心肌在恢复血液供应后，不仅不能完全恢复组织器官的功能，反而会出现心肌顿抑、再灌注性心律失常等较再灌注前更加严重的损伤的现象。心肌在正常情况下即能产生一定数量的氧自由基用于机体各种代谢需要。心脏针对氧自由基有其自身的清除机制，即内源性氧自由基清除酶，主要有SOD、CAT、GSH－Px等。内源性氧自由基清除酶与体内的氧自由基之间保持着动态的平衡。

由冠状动脉的阻塞或者闭锁引起的心肌缺血，导致一系列复杂的细胞事件，引起心肌细胞的死亡。虽然再灌注后局部缺血组织的血供得到改善，但同时也会对心肌细胞产生损伤[2]。再灌注因为能导致心肌细胞肿胀、肌原纤维破坏、收缩带形成和线粒体内的钙磷酸盐沉积，故而可加速细胞坏死和对细胞膜的损伤。氧自由基对组织细胞的损害被认为是心肌缺血再灌注损伤的重要因素之一[3]。当心肌缺血再灌注发生时，氧自由基大量产生，如超氧阴离子、过氧亚硝酸盐、羟自由基、一氧化氮、过氧化氢等，超出了自由基清除酶的清除能力。过多的氧自由基可以激发链式脂质过氧化反应，造成细胞膜的损伤[4]。大量氧自由基与细胞膜和各种细胞器膜发生脂质过氧化反应，生成MDA，从而影响细胞膜的完整性、流动性以及通透性。MDA作为氧自由基作用于胞膜不饱和脂肪酸所产生的代谢产物，可间接反映心肌缺血再灌注损伤的程度[5]。LDH、CKMB主要存在于心肌细胞胞质中，当胞膜发生脂质过氧化反应，胞膜的完整性及通透性发生改变时，它们会从细胞内大量释放入血液中，故其可作为判断心肌细胞受损程度的敏感指标[6]。SOD和CAT是体内重要的抗氧化酶，具有清除氧自由基的作用，其活性可以反映机体清除氧自由基的能力。

我国的稀土储存量和产量均位于世界首位，稀土纳米材料的开发应用扩大了稀土的使用范围。CeO2纳米颗粒作为一种稀土材料，被广泛用于催化、发光、储氢、陶瓷等多个领域[7]。研究[8]表明，CeO2纳米颗粒能够通过弱化心肌细胞的氧化应激来改善心肌功能障碍;能够保护胃肠皮层细胞避免放射引发的伤害，同时CeO2纳米颗粒使组织中的活性氧产生减少，并提高SOD活性[9]。纳米颗粒的生物学效应与其表面积大小密切相关，而随着纳米颗粒的减小，其表面积呈指数增加趋势。纳米颗粒的大小与其生物学效应有一定的相关性[10]。CeO2纳米颗粒特殊的空间构造使其具有特殊的生物学效应，同时存在的Ce3+和Ce4+在相互转化的过程中能够与组织中的氧自由基结合，减少氧自由基含量[1]。

在该研究中，模型组心肌组织由于脂质过氧化产生的MDA含量显著升高，LDH、CK－MB活性明显降低，均表明了再灌注对心肌细胞膜的损伤。另外，内源性抗氧化酶SOD、CAT的活性下降，进一步证实了模型组中氧化应激的发生。光镜下可见模型组中心肌细胞肿胀及炎性细胞浸润现象较假手术组严重，CeO2纳米颗粒组较模型组上述现象明显减轻。

该研究结果表明，CeO2纳米颗粒能减轻大鼠缺血再灌注损伤心肌组织中的氧化应激，明显提高再灌注损伤心肌组织中内源性抗氧化酶SOD、CAT的活性和LDH、CK－MB的活性，降低MDA的含量，改善心肌细胞的组织学形态，对心肌细胞起到较好的保护作用。但其确切的作用机制及临床应用的安全性方面仍然需要进行大量深入的研究。

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