食管鳞状细胞癌组织中FOXO3a、EGFR和CyclinD1蛋白的表达

常 佳，任景丽，杨鲲鹏，王立东

1)郑州大学第二附属医院胸外科 郑州 450014 2)郑州大学第二附属医院病理科 郑州 450014 3)河南省食管癌重点开放实验室 郑州 450052

食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)预后极差，病死率高，严重危害人类的生命与健康。ESCC的形成是一个多因素相互作用、多阶段发展、多基因变异的复杂过程[1]，环境和遗传因素的交互作用对食管癌的发生发展起重要作用[2]，其确切的发病机制仍不十分清楚。食管癌的治疗现状尚不十分乐观，术前新辅助放化疗不能明显降低术后局部复发率[3]。转录因子FOXO3a是一种重要的抑癌基因，在人体内广泛参与细胞信号转导、增殖、凋亡、氧化应激、内环境的稳定等过程，已成为肿瘤靶向治疗研究的热点之一[4]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)和细胞周期蛋白D1(CyclinD1)是原癌基因，参与多种肿瘤的形成。作者采用免疫组化方法检测了ESCC和正常食管黏膜组织中FOXO3a、EGFR和CyclinD1的表达以及三者的关系，并分析它们与ESCC临床病理特征的关系，以期为ESCC的靶向治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取郑州大学第二附属医院胸外科2011年5月至2013年5月ESCC手术切除标本87例，每例标本于手术切除后取癌及正常食管黏膜组织(距原发性肿瘤边缘5 cm以上)，常规制备蜡块，均经两位病理科医师证实为ESCC或正常食管黏膜组织。所有患者术前均未行放化疗或其他抗肿瘤治疗。87例患者中男57例，女30例;年龄46～81岁，其中＞60岁55例;组织学分级G1、G253例，G334例;肿瘤浸润深度 T1、T256例，T3、T431例;有淋巴结转移36例，无淋巴结转移51例;依据TNM分期标准(UICC 2009版)，Ⅰ、Ⅱ期69例，Ⅲ、Ⅳ期18例。

1.2 ESCC及正常食管黏膜组织中3种蛋白的免疫组化检测 FOXO3a兔抗人多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，EGFR鼠抗人单克隆抗体和CyclinD1兔抗人单克隆抗体购自基因科技(上海)有限公司，Envision试剂盒和DAB显色试剂盒购自Dako公司。将制备的蜡块连续4 μm厚切片，严格按照试剂说明书操作。FOXO3a抗体、EGFR抗体和CyclinD1抗体均按1∶100稀释。用已知ESCC组织的阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判定 FOXO3a阳性染色主要定位于细胞核，EGFR定位于细胞膜和细胞质，CyclinD1主要定位于细胞核，均表现为棕黄色或棕褐色颗粒。高倍镜下选择5个视野，每个视野计数100个细胞。按染色深浅和阳性细胞百分比评定。染色深浅:无染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;阳性细胞百分比:0为0分，～10%为1分，～50%为2分，～75%为3分，＞75%为4分。两项评分的乘积≥4分为阳性。

1.4 统计学处理 应用SPSS 17.0处理数据。采用配对χ2检验比较ESCC和正常食管黏膜组织中FOXO3a、EGFR、CyclinD1蛋白阳性表达率的差异;采用χ2检验比较ESCC组织中 FOXO3a、EGFR、CyclinD1蛋白的表达与患者一般人口学特征及临床病理因素的关系;采用列联系数分析ESCC组织中3指标的关联性。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 ESCC和正常食管黏膜组织中FOXO3a、EGFR和CyclinD1蛋白的表达 见图1、表1～3。正常食管黏膜和ESCC组织中FOXO3a蛋白的阳性表达率分别为70.1%和13.8%，EGFR蛋白的阳性表达率分别为10.3%和64.4%，CyclinD1蛋白的阳性表达率分别为14.9%和72.4%。

图1 ESCC和正常食管黏膜组织中FOXO3a(A)、EGFR(B)及CyclinD1(C)蛋白的表达(SP，×100)

表1 正常食管黏膜和ESCC组织中FOXO3a蛋白的表达 例

表2 正常食管黏膜和ESCC组织中EGFR蛋白的表达 例

表3 正常食管黏膜和ESCC组织中CyclinD1蛋白的表达 例

2.2 ESCC 组织中 FOXO3a、EGFR 和 CyclinD1蛋白的表达与患者一般人口学特征及临床病理因素的关系 见表4。在ESCC组织中，FOXO3a蛋白的表达仅与组织学分级有关;EGFR蛋白的表达与组织学分级、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关;CyclinD1蛋白的表达与浸润深度、淋巴结转移有关。

表4 ESCC组织中3种蛋白的表达与患者一般人口学特征和临床病理因素的关系 阳性例数(%)

2.3 ESCC 组织中 FOXO3a、EGFR、CyclinD1 蛋白表达的关联性 见表5、6。

表5 ESCC组织中FOXO3a和EGFR、CyclinD1蛋白表达的关联性 例

表6 ESCC组织中EGFR、CyclinD1蛋白表达的关联性 例

3 讨论

FOXO3a是叉头转录因子O亚家族(forkhead transcription factor O subfamily，FOXO)中的一员，其在细胞增殖和凋亡中起核心作用[5-7]。FOXO3a在乳癌、卵巢癌、前列腺癌等组织中的表达水平下降[4]。该研究中FOXO3a在ESCC组织中的表达水平亦下降，且其阳性表达与肿瘤组织学分级有关，组织分化越高其表达水平越高，提示FOXO3a基因活性的降低可导致肿瘤的发生，且其表达水平与肿瘤的恶性程度有关。

EGFR是一种由原癌基因c-erbB编码的跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性。EGFR在多种恶性肿瘤细胞中高表达[8]。该研究中EGFR在ESCC组织中的阳性表达率高于正常食管黏膜组织，与王立东等[9]的EGFR在食管各级病变中的表达升高和尤超等[10]的EGFR在ESCC组织中高表达一致，且其阳性表达与组织学分级、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关。由此作者推测EGFR与肿瘤细胞的增殖、分化、细胞黏附力、侵袭和转移有关，EGFR蛋白高表达的患者肿瘤恶性程度高，易发生转移，预后较差。

CyclinD1是细胞从G1期进入S期的重要调控因子。CyclinD1在乳癌、肝癌、结直肠癌等多种肿瘤组织中过表达[11]。该研究结果显示CyclinD1蛋白在ESCC组织中亦高表达，其阳性表达与肿瘤的浸润深度和淋巴结转移有关;肿瘤浸润越深，CyclinD1蛋白的表达越低，提示CyclinD1可能在癌变早期扩增，检测CyclinD1有助于ESCC的早期诊断。

FOXO3a和EGFR均参与磷脂酰肌醇3-激酶/丝-苏氨酸激酶(phosphoinositide 3-kinase/serine threonine kinase，PI3K/AKT)信号传导通路。AKT依赖磷酸化 FOXO3a的调节作用[12]，EGFR在PI3K/AKT信号传导通路中对细胞增殖、分化、播散起重要作用[13]。该研究结果显示，在ESCC组织中FOXO3a与EGFR蛋白的表达呈负关联，由此作者推测，EGFR原癌基因激活可通过PI3K/AKT信号传导通路抑制FOXO3a基因的活性，下调FOXO3a蛋白的表达，共同参与ESCC的发生发展。FOXO3a与CyclinD1蛋白表达呈负关联，提示FOXO3a转录可抑制CyclinD1的活性，进而影响细胞增殖与凋亡。另外，该研究结果还显示CyclinD1与EGFR蛋白的表达呈正关联。CyclinD1是EGFR在核内的靶蛋白[14]，EGFR可直接转运入核，调节 CyclinD1基因转录，共同参与ESCC的发生。

综上所述，FOXO3a、EGFR和CyclinD1与ESCC的发生发展密切相关，可为ESCC的早期诊断和预后评价提供一定的参考，并有望为治疗提供新的靶点。

[1]Tanaka F，Ishikawa K，Mori M.Molecular mechanisms of generation and progression of esophageal cancer[J].Nihon Rinsho，2011，69(Suppl 6):62

[2]王立东，宋昕.环境和遗传因素交互作用对食管癌发生的影响[J].郑州大学学报:医学版，2011，46(1):1

[3]朱炜.术前新辅助放化疗与单纯手术对可切除食管癌疗效的Meta分析[J].解放军医学杂志，2011，36(8):813

[4]Yang JY，Hung MC.A new fork for clinical application:targeting forkhead transcription factors in cancer[J].Clin Cancer Res，2009，15(3):752

[5]Myatt SS，Lam EW.The emerging roles of forkhead box(Fox)proteins in cancer[J].Nat Rev Cancer，2007，7(11):847

[6]Fu Z，Tindall DJ.FOXOs，cancer and regulation of apoptosis[J].Oncogene，2008，27(16):2312

[7]Dansen TB，Burgering BM.Unravelling the tumor-suppressive functions of FOXO proteins[J].Trends Cell Biol，2008，18(9):421

[8]Lo HW，Hsu SC，Hung MC.EGFR signaling pathway in breast cancers:from traditional signal transduction to direct nuclear translocalization[J].Breast Cancer Res Treat，2006，95(3):211

[9]王立东，任景丽，宋昕，等.食管癌变过程中肿瘤相关蛋白的表达[J].郑州大学学报:医学版，2009，44(1):13

[10]尤超，温洪涛，关冰.食管鳞状细胞癌组织中LRIG3和EGFR蛋白的表达[J].郑州大学学报:医学版，2012，47(2):147

[11]Gunia S，Kakies C，Erbersdobler A，et al.Expression of p53，p21 and cyclin D1 in penile cancer:p53 predicts poor prognosis[J].J Clin Pathol，2012，65(3):232

[12]Reagan-Shaw S，Ahmad N.The role of Forkhead-box Class O(FoxO)transcription factors in cancer:a target for the management of cancer[J].Toxicol Appl Pharmacol，2007，224(3):360

[13]Hubbard SR，Miller WT.Receptor tyrosine kinases:mechanisms of activation and signaling[J].Curr Opin Cell Biol，2007，19(2):117

[14]Lo HW，Hsu SC，Xia W，et al.Epidermal growth factor receptor cooperates with signal transducer and activator of transcription 3 to induce epithelial-mesenchymal transition in cancer cells via up-regulation of TWIST gene expression[J].Cancer Res，2007，67(19):9066