抗-M抗体引起多次宫内死胎的血型血清学及基因分析

马 玲，刘衍春，吴敏慧，刘 毅，郑 凌，薛 敏

0 引 言

母婴间血型不合有可能导致胎儿及新生儿溶血病(hemolytic disease of the fetus and newborn，HDFN)，该类溶血性疾病在新生儿期较为常见，主要是母体产生了针对胎儿红细胞抗原的IgG型抗体，通过胎盘进入胎儿体内，与胎儿红细胞上抗原结合，引起细胞聚集、破坏等一系列病理反应，可以引起贫血、水肿、肝脾肿大，胎儿出生后短时间内出现进行性重度黄疸，严重者可发生胆红素脑病，甚至导致死胎［1－3］。HDFN最常见的发生于 ABO系统，但症状一般较轻;其次是Rh系统;此外MNS系统、Kidd系统、Digeo系统等引起HDFN的情况也偶见报道［4］。本研究对1例多次宫内死胎的案例，通过其血清学及基因的分析，确诊由抗-M抗体引起HDFN，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 病例简介 某经产妇，34岁，无输血史，2005－2012年共怀孕5次，其中第3胎B超提示胎心减弱，胎儿宫内窘迫提前剖宫产娩出，产后新生儿贫血，肝脾肿大，Apgar评分2～4分，血红蛋白124 g/L，总胆红素58.7 μmol/L，直接胆红素 14.2 μmol/L，红细胞直抗为阳性，输注红细胞悬液纠正贫血后血红蛋白上升，因家属担心预后放弃治疗，新生儿死亡;该经产妇其余胎次均提示胎儿宫内发育异常后流产，具体情况见表1。

表1 多次宫内死胎经产妇的孕产史情况Table 1 Pregnancy history of the woman with multiple intrauterine deaths

1.2 主要试剂与仪器 单克隆抗-A、抗-B、抗-D、抗-M、抗-N抗体、2-Me及筛选细胞(上海输血技术公司);基因组DNA提取试剂盒(原平皓公司);人类 MNS，Duffy，Kell，Dombrock，Diego，Kidd，Scianna，Colton，Lutheran血型系统基因分型检测试剂盒(天津秀鹏生物技术公司);Labofuge 400R低温高速离心机(Heraeus Corp，Germany);PE9600PCR扩增仪(Applied Biosystem Corp，USA);AlphalmagerHP凝胶成像系统(Alphalmager Corp，USA)。

1.3 方法

1.3.1 血型鉴定 采集该夫妇(以下简称母亲、父亲)外周静脉血，血样经EDTA抗凝，试管法常规ABO正反定型，RhD血型及MN血型定型。另对该夫妇MN血型进行基因分型:各取0.5 mL全血，用DNA提取试剂盒提取DNA;根据人类MNS，Duffy，Kell，Dombrock，Diego，Kidd，Scianna，Colton，Lutheran血型系统基因分型检测试剂盒要求，调整DNA模板浓度约为30ng/μL，进行PCR-SSP扩增;取10μL扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统拍照分析。

1.3.2 抗体筛查与鉴定 取母亲血清与谱细胞进行盐水介质和抗人球试验，根据谱细胞格局判断母亲血清中抗体的存在与否及种类。

1.3.3 抗体效价 用2-Me室温处理母亲血清30 min，破坏IgM型抗体后，用O型、MM纯合子红细胞检测IgG型抗-M效价，共检测4次。

2 结 果

2.1 血型 血清学结果:母亲血型:A，RhD+，N+;父亲血型:A，RhD+，M+;第3胎新生儿血型:A，RhD+，M+N+。基因型结果:母亲基因型:NN;父亲基因型:MM，结果见图1(箭头所指处分别为N和M目的条带)。

图1 MN血型基因PCR结果Figure 1 PCR genotyping of the MN blood type

2.2 抗体筛查与鉴定 母亲血清与MM，MN谱细胞在盐水介质和间接抗人球蛋白试验IAT(indirect antiglobulin test，IAT)中均有反应，而与NN细胞无反应，根据反应格局可以确定为抗-M抗体，且为IgM型与IgG混合型，具体格局见表2。

表2 孕妇血清与谱细胞反应格局Table 2 Reaction pattern of maternal serum

2.3 抗体效价 2011年10月，孕前检测，为1∶8;2011年11月，第4胎孕4w+6时，为1∶32;2011年12月，第4胎孕10w+5时，为1∶32;2012年10月，第5胎孕6w+5时，为1∶64。

3 讨 论

MNS血型系统是继ABO后第2个被发现的血型系统，其复杂性仅次于Rh系统，含有46个抗原［5］;MNS系统的大多数抗原在出生时即发育完全。其中熟知的与HDFN相关抗原包括:M、N、S、s及U抗原，前两者位于血型糖蛋白A上，后三者位于血型糖蛋白B上，都为一次穿膜蛋白。红细胞膜上高表达血型糖蛋白A，约106个/细胞，血型糖蛋白B的表达略低，约2×105个/细胞;由于M抗原的高表达，一些高滴度的IgG性质抗体在盐水条件下也能凝集红细胞;而一些高滴度的IgM性质抗体在37℃仍与红细胞有反应。此外需要注意的是，血型糖蛋白B蛋白位于细胞膜外的26个氨基酸残基序列同N抗原序列一样，导致一些抗-N试剂也可以与纯合子的MM红细胞发生弱凝集，因此在表型鉴定、解释结果的时候需谨慎。

抗-M抗体属于MNS系统中较为常见的一种抗体，大多数抗-M抗体为IgM型，无补体结合性质，只在低于37℃的温度下有反应，且最适反应温度为4℃，因此临床意义不大。但是少数抗-M抗体为IgG性质，能够引起急性和迟发性溶血性输血反应及HDFN。抗-M抗体具有几个特点［6］:一是剂量效应，与纯合子细胞反应明显强于杂合子细胞，因此对于一些较弱的抗体，需用纯合子细胞才能验证;二是pH值依赖性。抗-M抗体的最适反应pH值为6.5，高于7.5时几乎无反应性，低于pH6.5时变得无特异性;实验时，适当加入EDTA等酸性溶液可以增强弱抗体与红细胞的反应。

高翔羽等［7］在总结分析了国内20余例抗-M抗体引起 HDFN的报道后发现，抗-M抗体引起的HDFN其病情轻重程度差异较大。有些患儿表现为不同程度的贫血、黄疸，给予光照治疗或静脉注射免疫球蛋白后治愈;但少部分严重者需要换血甚至导致死胎。本文报道的案例即为极少数严重案例，母亲为N+表型，父亲为M+表型，且基因分型的结果进一步佐证了血清学结果，都为纯合子;母亲体内检出抗-M抗体，该抗体引起多次宫内死胎，且病因学在第3胎产后才被确诊。

抗-M抗体效价的高低并不能直接反应HDFN的严重程度。Wikman等［8］发现效价低至1的抗-M抗体也可引起严重的HDFN;Poole和Daniels［9］认为用自动分析仪检测抗体的含量比检测血清滴度更能有效地预测HDFN的严重水平;当抗体含量水平较高时(10～15 U/mL)，就可能需要用羊水或脐带血来进一步估计胎儿的溶血情况。一些细胞生物学的方法，如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用、单核细胞单层试验、化学发光试验能够更有效地预测HDFN的严重性。

抗-M抗体导致的HDFN，其细胞直接抗人球蛋白试验(direct antiglobulin test，DAT)也可以是阴性。Wikman等［8］用51Cr分别标记M+N－和M－N+红细胞，注射于含有抗-M抗体的经产妇体内，发现M+N-红细胞半衰期为2 h，4 h后标记的细胞即被清除;而M-N+红细胞有着正常地生存期，29 d后仍有50%的标记细胞存活。这可能解释了红细胞DAT阴性的原因，即血管内清除较快;Wikman还提出DAT阴性的另一个可能原因，即与抗-K，抗-Ge导致的HDFN机制类似，MNS等抗原表达于红系祖细胞上，抗-M更多的是导致了红系祖细胞的破坏而非成熟的红细胞［10］。

目前国内大多数医院并未将MN血型检查列入常规检查项目，又因为抗-M抗体引起的HDFN临床发生率较低，故临床医师对此病的认识较为陌生，易引起漏诊及误诊。总之，对于原因不明的多次死胎，流产等，在排除了其他可能因素后，需要考虑到抗-M抗体或其他血型抗体引起的可能性。

［1］Basu S，Kaur R，Kaur G.Hemolytic disease of the fetus and newborn:Current trends and perspectives［J］.Asian J Transfus Sci，2011，5(1):3-7.

［2］Roberts IA.The changing face of haemolytic disease of the newborn［J］.Early Hum Dev，2008，84(8):515-523.

［3］李 勇，马学严.实用血液免疫学［M］.北京:科学出版社，2006:207-235.

［4］陈 忠，张莉尼.国内非ABO血型新生儿溶血病病例回顾分析［J］.中国输血杂志，2000，13(1):46-47.

［5］Roback JD.Technical Manual［M］.Bethesda:American Association of Blood Banks，2011:411-414.

［6］杰夫·丹尼尔.人类血型［M］.朱自严译.北京:科学出版社，2007:171.

［7］高翔羽，黄 欢，李立达.新生儿MN溶血病一例并21例文献复习［J］.中华儿科杂志，2009，47(9):648-651.

［8］Wikman A，Edner A，Gryfelt G.Fetal hemolytic anemia and intrauterine death caused by anti-M immunization［J］.Transfusion，2007，47(5):911-917.

［9］Poole J，Daniels G，Blood Group Antibodies and Their Significance in Transfusion Medicine［J］.Transfus Med Rev，2007，21(1):58-71.

［10］Rashmi T，Rahul K.Anti-M:Report of two cases and review of literature［J］.Asian J Transfus Sci，2008，2(2):81-83.