莱菔硫烷抗凋亡对移植大鼠心脏的保护作用

王 帅，伊 雪，邬鹏宇，崔翔宇，杨学慧，王耕野，郑素琴，杨 方，李占清

0 引 言

心肌细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，IRI)占有重要地位［1］。莱菔硫烷(Sulforaphane，SFN)能通过抑制心肌细胞凋亡，减轻离体心脏的心肌IRI［2］，然而对心脏移植的IRI是否有保护作用尚未见报道。本实验通过建立大鼠腹腔同种异体异位心脏移植模型，观察SFN是否通过调控细胞凋亡来减轻心脏移植的IRI。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性Lewis大鼠60只，BN大鼠20只，3月龄，体重200～220g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号:SCXX(京)2011-0007，清洁级(SPF)，饲养于河北联合大学动物实验中心，自由进食饮水，室温控制在(25±2)℃，单笼饲养，自然光照。SFN购自美国Sigma公司，HTK液(德国克勒化学制药生产)由德国海德堡大学提供，抗Caspase-3抗体购自英国Abcam公司，Tunel试剂盒购自德国Calbiochem公司。

1.2 实验分组及模型建立 Lewis大鼠40只，配对比较法随机分为2组，每组20只。对照组:受体大鼠于移植前24 h经尾静脉注射等渗盐水0.5 mL;实验组:受体大鼠于移植前24 h经尾静脉注射SFN 2.5 mg/kg。实验组和对照组的供心均冷藏于4℃ HTK液18h，建立大鼠心脏移植模型［3］。具体操作如下:经大鼠腹腔注射苯巴比妥钠(20 mg/kg)、肌内注射氯胺酮(100mg/kg)麻醉后，摘取供体大鼠心脏，将供心升主动脉、肺动脉与受体大鼠腹主动脉、下腔静脉端侧吻合;吻合完毕后放开阻断夹见冠状动脉充血，5～10s心脏复跳，检查吻合口无出血，关腹。

1.3 移植心脏存活时间 20只BN大鼠作为供体，20只Lewis大鼠作为受体，每组各10只。对照组及实验组的处理同上述。建立心脏移植模型后，每天早晚2次触摸受体腹部，了解移植心脏跳动情况，直至其停止跳动，记录移植心脏存活天数，使用Kaplan-Meier分析其生存率。

1.4 观察指标 ①生存率:采用Kaplan-Meier方法进行生存率分析;②移植心脏功能:采用半定量方法评价移植心脏的功能［4］，即心脏吻合完毕后放开阻断夹，然后通过直接触诊、肉眼及显微镜观察移植物来评价移植心脏的功能，共分为4分。1分:能通过显微镜可见肌束颤动和肌纤维颤动，但触摸不到;2分:能触摸到弱的或局部的心肌收缩;3分:两心室同源性收缩，但心跳的频率和强度降低;4分:收缩的强度和频率正常。③心肌细胞凋亡指数:移植后24h摘取移植心脏，留取心肌组织标本，应用Tunel法检测心肌细胞凋亡。④心肌组织中Caspase-3蛋白的表达:移植后24h摘取移植心脏，留取心肌组织标本，应用免疫组织化学检测心肌组织Caspase-3蛋白表达，并按照半定量分析方法进行免疫组化评分［5］。

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料数据以均数±标准差()表示，组间比较采用t检验，采用Kaplan-Meier方法进行生存率分析，组间比较用 Logranke检验。以 P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 生存率 采用Kaplan-Meier方法进行生存率分析，实验组移植心脏的中位生存期与对照组比较明显提高(7 d vs 5 d，P ＜0.05)，见图1。

图1 2组大鼠移植心脏存活时间比较Figure 1 Comparison of the survival time of the transplanted heart in rats

2.2 移植心脏功能评分 移植后实验组移植心脏的功能评分较对照组明显提高［(3.67±0.21)分 vs(2.44±0.29)分］，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表1。

2.3 心肌组织中Caspase-3蛋白的表达 对照组大量的心肌细胞细胞质呈阳性染色，且染色较深;实验组细胞质呈阳性染色较浅，见图2。与对照组相比，实验组大鼠心脏组织中Caspase-3蛋白免疫组化评分明显下降［(1.38 ±0.14)分 vs(2.03 ±0.21)分，P=0.039］，见表1。

图2 移植24h后2组大鼠心肌组织中Caspase-3蛋白的表达(IHC ×200)Figrue 2 Expression of Caspase-3 in myocardium tissues at 24h after heart transplantation in rats(IHC×200)

2.4 心肌细胞凋亡指数 对照组大量的心肌细胞核染成褐色或棕褐色，可见大量的凋亡细胞;实验组凋亡细胞明显减少。见图3。移植24 h后，实验组供心心肌细胞凋亡指数较对照组显著降低(0.56±0.04 vs 0.78 ±0.01，P ＜0.05)，见表1。

图3 移植24h后2组大鼠心肌细胞凋亡比较(TUNEL ×400)Figure 3 Myocardial apoptosis at 24 h after heart transplantation in rats(TUNEL×400)

表1 大鼠移植心脏功能评分、Caspase-3蛋白的表达及心肌细胞凋亡指数比较()Table 1 Comparison of cardiac function scores，the expression of Caspase-3 and the apoptosis index of myocardial cells at 24 h after heart transplantation in rats()

表1 大鼠移植心脏功能评分、Caspase-3蛋白的表达及心肌细胞凋亡指数比较()Table 1 Comparison of cardiac function scores，the expression of Caspase-3 and the apoptosis index of myocardial cells at 24 h after heart transplantation in rats()

与对照组相比，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01

指 标 对照组(n=20) 实验组(n=20)移植心脏功能评分(分) 2.44 ±0.29 3.67 ±0.21*Caspas-3 蛋白表达(分) 2.03 ±0.21 1.38 ±0.14*心肌细胞凋亡指数 0.78 ±0.01 0.56 ±0.04＊＊

3 讨 论

心肌缺血和再灌注损伤中存在2种不同的细胞死亡方式，即凋亡和坏死。心肌缺血损伤中以坏死为主，而IRI中以凋亡为主。研究表明，细胞凋亡在心肌IRI中占有重要地位［1］。Caspsase-3是调亡蛋白酶级联反应的必经之路［6］，被认为是导致细胞凋亡的关键酶，被称作死亡蛋白酶，它的激活标志着细胞凋亡的开始［7］。

近年来研究表明，SFN能直接作用于Keap1，使Keap1与 Nrf2分开，后者与 ARE结合从而激活Nrf2-ARE信号通路，诱导内源性II相酶(phase II enzyme)的表达，清除缺血再灌注或外来物产生的活性氧自由基［4，8］，减轻 IRI［9］。Angeloni等［10］给予幼鼠的心室肌细胞不同时间(30 min～48 h)SFN(5 μmol/L)的预处理，发现SFN能明显提高Ⅱ期酶的活性、蛋白及基因的表达，说明SFN通过诱导二期酶的产生，发挥抗氧化作用，增强细胞对氧化应激的防御能力，发挥其保护心肌的作用。Piao等［11］在大鼠的离体心脏的IRI同样发现SFN通过抗氧化作用减轻心肌的组织损伤。而SFN是否通过抗凋亡作用减轻IRI未见报道。

本实验的结果显示:与对照组相比，SFN预处理能明显抑制 Caspase-3 蛋白的表达(2.03 ±0.21 vs 1.38 ±0.14，P ＜0.05);同样 Tunel结果显示:与对照组相比，经SFN预处理组移植心脏的细胞凋亡指数明显降低(0.78 ±0.01 vs 0.56 ±0.04，P ＜0.05)。我们考虑 SFN在心肌的冷IRI中同样起作用，SFN预处理能明显降低由于IRI引起的Caspase-3水平的升高，从减轻心肌细胞的凋亡，减轻心肌的组织损伤。与Piao等［11］的研究结果相一致。同样我们研究发现SFN能提高移植心脏的中位生存期(7d vs 5d，P＜0.05)和改善移植心脏功能(3.67 ±0.21 vs 2.44 ±0.29，P ＜0.05)，SFN 能够减轻心脏移植中IRI，提高移植心脏的存活时间和功能。这与 Sołowiej等［12］研究相一致。

总之，SFN能减轻移植心脏心肌IRI，其保护作用可能与其抑制Caspase-3蛋白的表达，同时减少心肌细胞凋亡有关，但其具体机制尚需进一步探讨。

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