1，25－二羟维生素D3对哮喘豚鼠肥大细胞类胰蛋白酶释放的影响

夏 维，石敦义，张桂蓉

（1.重庆市长寿区人民医院呼吸内科 401220；2.重庆医科大学附属第二医院保健科 400010）

1，25－二羟维生素D3是维生素D的活性形式，除了调节钙和骨代谢外，还发挥其他生物活性，如通过多种途径参与免疫调节活动。近期大量研究表明，1，25－二羟维生素D3与哮喘慢性气道炎症呈明显的负相关［1－4］，可通过多种途径影响哮喘免疫机制［5－6］。哮喘的发病机制与Ⅰ型变态反应密切相关，而类胰蛋白酶是肥大细胞最多的炎症介质，具有多种生物活性，是肥大细胞激活和介导疾病的标志［7－8］。本研究拟通过1，25－二羟维生素D3对哮喘豚鼠干预治疗后，观察哮喘豚鼠气道反应性及肺组织病理、类胰蛋白酶分布的变化，探讨1，25－二羟维生素D3对哮喘变态反应方面的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验动物及分组：健康豚鼠30只，雌雄不限，体质量264～362g，由重庆医科大学动物实验中心提供。将30只豚鼠分为对照组（A组）、哮喘组（B组）、1，25－二羟维生素D3组（C组），每组10只。（2）主要试剂：卵清蛋白（OVA）、1，25－二羟维生素D3、氯化乙酰胆碱（Ach）均购自美国sigma公司；速眠新由第三军医大学提供；402型超声雾化器购自上海四菱医疗器械厂；自制密闭有机玻璃箱6L（20cm×20cm×20 cm）；抗Tryptase单克隆抗体AA1（一抗）与SP工作试剂盒均由福建迈新公司提供。

1.2 方法

1.2.1 造模及给药方法 哮喘模型的建立：B、C组每只豚鼠腹腔内注射10%OVA溶液1mL致敏，2周后将豚鼠置于密闭有机玻璃箱内，用超声雾化器喷入1%OVA溶液15～30 min。观察豚鼠反应，以出现烦躁、呛咳、呼吸加快等典型的哮喘发作症状为成功动物模型。A组以等量生理盐水进行腹腔注射和雾化，方法同前，上午花生油1mL灌胃，连续15d。B组上午花生油1mL灌胃；C组1，25－二羟维生素D3以2.5μg·kg－1·d－1融入1mL花生油后进行灌胃，均持续15d。第30天按计划取材。

1.2.2 气道反应性测定 豚鼠速眠新麻醉后将其仰卧固定于手术台上，分离暴露出颈内静脉和气管，分别行颈内静脉及气管插管，置于动物肺功能检测分析系统的密闭体积描记箱内，通过动物呼吸机辅助通气，设置呼吸机潮气量6mL／kg，呼吸频率为每分钟70次。先给予生理盐水静脉注射，记录呼气相气道阻力（Re）并作为基础值。而后分次按浓度倍增法依次静脉注射Ach，连续记录Ach注射前、后Re，每次待Re降至正常后再开始下一个剂量，所有动物均给予以下4个剂量：40、80、160、320μg／kg。结果以 Re增高率（Re的实测值／基础值×100%）表示。

1.2.3 肺泡灌洗液（BALF）细胞计数 结扎豚鼠右主支气管，插入连接有注射器的硅胶管，行肺泡灌洗2次，每次4～6 mL，回收率大于80%为成功。回收的BALF予离心机离心（1 500r／min）10min，细胞残渣经稀释滴于血细胞计数板上，40倍光镜下计数细胞总数，HE染色，行细胞分类。

1.2.4 肺组织HE染色及类胰蛋白酶免疫组化染色 取右侧上叶肺组织标本，制成4μm厚的切片，作HE及类胰蛋白酶免疫组化染色，观察气道肺组织的病理改变及肥大细胞类胰蛋白酶颗粒分布情况。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0软件进行统计分析，数据用表示，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组豚鼠一般情况比较 A组豚鼠雾化吸入生理盐水后呼吸无任何变化，豚鼠行动敏捷，实验过程中无死亡。B组豚鼠雾化吸入OVA后出现呼吸急促，腹式呼吸明显，部分豚鼠可听到哮鸣音，重者出现跌倒，抽搐，实验第1天超敏死亡1只。C组灌胃时误入气管死亡豚鼠1只，豚鼠初期雾化吸入OVA出现哮喘样反应，后期经1，25－二羟维生素D3灌胃后精神饮食逐渐好转，但较A组差。

2.2 气道反应性测定 3组豚鼠气道内阻力基础值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。随着Ach浓度的增加，B组Re较A组明显增高（P＜0.05），尤其在160～320mg／mL时；C组与A组比较有类似变化。C组Re较B组明显降低（P＜0.05），见表1。

2.3 支气管BALF细胞计数及分类 B组BALF细胞总数高于A组，其中以嗜酸性粒细胞增高最为明显（P＜0.05）。C组BALF细胞总数及嗜酸性粒细胞比例较B组明显下降（P＜0.05），见表2。

2.4 肺组织HE染色 B组气管黏膜组织中大量炎症细胞浸润，以嗜酸性粒细胞为主，其次为中性粒细胞、淋巴细胞等；支气管管腔缩窄，内有大量黏液栓形成，部分气道上皮脱落。气道平滑肌细胞明显增生、肥大，导致平滑肌层增厚。C组气道黏膜非特异性炎症明显减轻，A组则无此病理改变。

表1 3组豚鼠Re比较（x±s，cm H2O／mL·s）

表2 3组豚鼠BALF细胞计数及分类（x±s）

图1 A组Tryptase阳性细胞表达（×400）

2.5 肺组织类胰蛋白酶免疫组化染色 A组Tryptase阳性细胞表达很少，主要散布在黏膜下、肺泡间隔，见图1。B、C组Tryptase阳性细胞表达则明显增多，主要聚集在气管黏膜下、肺泡间隔、血管周围，一些Tryptase阳性颗粒散布在细胞外，见图2、3。B组Tryptase阳性细胞为（17.3±1.19）与 A组（3.2±0.98）比较差异有统计学意义（P＜0.05）；C组Tryptase阳性细胞（13.9±1.87）较B组（17.3±1.19）明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 B组Tryptase阳性细胞表达（×400）

图3 C组Tryptase阳性细胞表达（×400）

3 讨 论

哮喘的本质是由多种细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞等）和细胞组分参与的慢性气道炎症，这种慢性炎症与气道高反应性密切相关，常表现为Re增高。本实验采用OVA注射致敏、雾化吸入方式诱导复制哮喘动物模型。B组豚鼠在雾化吸入OVA后出现典型的哮喘样反应，Re增高，BALF细胞总数及嗜酸性粒细胞比例增高，肺组织气管上皮细胞肿胀、脱落，管腔变窄，管壁及管腔内有大量炎症细胞浸润，而A组则无上述改变，说明本实验哮喘模型制作成功。

近年来，大量研究表明维生素D与支气管哮喘发病密切相关，可能通过多种途径参与了哮喘的病因学［6］。Brehm等［9］在拉丁美洲哥斯达黎加地区进行横断面调查，回归分析显示1，25－二羟维生素D3缺乏与哮喘发病之间存在明显相关性，且1，25－二羟维生素D3水平越低，哮喘症状越严重。Sutherland等［10］研究发现，在哮喘患者中，维生素D水平与气道反应性、肺功能及糖皮质激素受体密切相关，即患者血清1，25－二羟维生素D3越低，其气道反应性越高（表现为Re增高），糖皮质激素受体敏感越低，肺功能越差。Majak等［11］在给哮喘患者补充维生素D后，发现能明显减低气道炎症反应，从而减少哮喘的急性发作。Boonstr等［12］研究发现，1，25－二羟维生素D3能增加辅助性T淋巴细胞（Th）向Th分化的趋势，Th1下调，Th2上调。在本实验中，C组经1，25－二羟维生素D3处理后，哮喘豚鼠BALF、气管及肺组织中的炎症细胞浸润均明显减轻，Re降低，提示1，25－二羟维生素D3确能减轻哮喘豚鼠的气道炎症反应，降低Re。

在哮喘的变态反应中，肥大细胞的激活至关重要，那么1，25－二羟维生素D3能否对肥大细胞的激活产生影响呢？类胰蛋白酶是一种相对分子质量为134×103的中性丝氨酸蛋白酶四聚体，它高度选择表达于肥大细胞，是肥大细胞激活的产物。在本实验中，B组豚鼠肥大细胞数量及类胰蛋白酶颗粒明显较A组增多，证实类胰蛋白酶参与了哮喘发病过程［13－15］。经1，25－二羟维生素D3处理后，哮喘豚鼠肥大细胞数量及释放的类胰蛋白酶颗粒均明显减少，说明维生素D可能有抑制肥大细胞激活及释放类胰蛋白酶颗粒的作用。

［1］Herr C，Greulich T，Koczulla RA，et al.The role of vitamin D in pulmonary disease：COPD，asthma，infection，and cancer［J］.Respir Res，2011，12（1）：31.

［2］Camargo CA Jr，Ingham T，Wickens K，et al.Cord－blood 25－hydroxyvitamin D levels and risk of respiratory infection，wheezing，and asthma［J］.Pediatrics，2011，127（1）：180－187.

［3］Li F，Peng M，Jiang L，et al.Vitamin D deficiency is associated with decreased lung function in Chinese adults with asthma［J］.Respiration，2011，81（6）：469－475.

［4］Majak P，Olszowiec－Chlebna M，Smejda K，et al.Vitamin D supplementation in children may prevent asthma exacerbation triggered by acute respiratory infection［J］.J Allergy Clin Immunol，2011，127（5）：1294－1296.

［5］Hansdottir S，Monick MM.Vitamin d effects on lung immunity and respiratory diseases［J］.Vitam Horm，2011，86（1）：217－237.

［6］Mak G，Hanania NA.Vitamin D and asthma［J］.Curr Opin Pulm Med，2011，17（1）：1－5.

［7］Bradding P，Walls AF，Holgate ST，et al.The role of the mast cell in the pathophysiology of asthma［J］.J Allergy Clin Immunol，2006，117（6）：1277－1284.

［8］Hallgren J，Pejler G.Biology of mast cell tryptase.An inflammatory mediator［J］.FEBS J，2006，273（9）：1871－1895.

［9］Brehm JM，Celedon JC.Serum vitamin D levels and markers of severity of childhood asthma in Costa Rica［J］.Am J Respir Crit Care Med，2009，179（8）：765－771.

［10］Sutherland ER，Goleva E，Jackson LP，et al.Vitamin D levels，lung function，and steroid response in adult asthma［J］.Am J Respir Crit Care Med，2010，181（7）：699－704.

［11］Majak P，Olszowiec－Chlebna M，Smejda K，et al.Vitamin D supplementation in children may prevent asthma exacerbation triggered by acute respiratory infection［J］.J Allergy Clin Immunol，2011，127（5）：1294－1296.

［12］Boonstr A，Barrat FJ，Crain C，et al.lalph 25－Dihydroxy vitamin D3has a direct effect on naive CD4（＋）T cells to enhance the development of Th2cells［J］.J Immunol，2001，167（9）：4974－4980.

［13］Molinari JF，Scuri M，Moore WR，et al.Inhaled tryptase causes bronchoconstriction in sheep via histamine release［J］.Am J Respir Crit Care Med，1996，154（3）：649－653.

［14］He S，Peng Q，Walls AF，et al.Potent induction of a neutrophil and eosinophil－rich infiltrate in vivo by human mast cell tryptase：selective enhancement of eosinophil recruitment by histamine［J］.J Immunol，1997，159（12）：6216－6265.

［15］Brown JK，Tyler CL，Jones CA，et al.Tryptase，the dominant secretory granular protein in human mast cells，is a potent mitogen for cultured dog tracheal smooth muscle cells［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，1995，13（8）：227－230.