人骨肉瘤中肾上腺髓质素和整合素αvβ3的表达及相关性研究

支力强，马 巍△，王维华，王小平

（1.西安交通大学医学院第一附属医院骨科，西安 710061；2.西安交通大学医学院流行病与卫生统计教研室，西安 710061；3.陕西中医学院分子病理学研究室，西安 712046）

骨肉瘤作为最常见的恶性成骨性肿瘤之一，高发于10～14岁的青少年，发病率在原发的儿童和青少年性恶性骨肿瘤中排第1位。具有高转移活性，恶性程度极高，主要通过血行转移到其他组织和器官。以往研究显示，肾上腺髓质素（ADM）和整合素αvβ3在肿瘤中表达异常，且其表达的强度与肿瘤恶性程度有关，表明二者与肿瘤的恶性生物学行为有密切联系［1－2］。而在人骨肉瘤中同时检测ADM和整合素αvβ3的表达，并分析二者与骨肉瘤临床病理因素之间关系的研究在国内外少见报道。为了阐述二者关系，对本院30例骨肉瘤患者肿瘤组织的石蜡标本中ADM和整合素αvβ3的水平进行了检测，并探讨二者之间的相关性及对骨肉瘤患者治疗和预后的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 取西安交通大学医学院第一、二附属医院自2006年6月至2013年6月经临床、病理、X线片确诊为骨肉瘤的患者30例，入院时所有患者均未接受正规化疗，为准确诊断，所有患者的活检检查均于放化疗之前进行。以2010年美国癌症联合委员会（ACJJ）对于骨肉瘤GTM分期法为标准对病例进行分期［3］，因GTM分期对于肿瘤分级（G）的判定没有明确的评判标准，故参考联邦法国癌症中心（FNCLCC）关于骨与关节肿瘤分级方法中骨肿瘤分级（G）的标准作为ACJJ法中分级（G）的补充，即按：Gx、G1＝1级，G2＝2级，G3、4＝3级［4］。再以Dahlin′s组织学分型为骨肉瘤的分型标准。其中男18例，女12例；年龄8～47岁，平均（18.42±9.10岁）。股骨下段肿瘤13例，胫骨上段10例，其他部位7例。就诊时未发生转移者28例，已发生转移者2例；其中Ⅱa期6例，Ⅱb期11例，Ⅲ期11例，Ⅳ期2例。骨母细胞型15例，软骨母细胞型5例，纤维母细胞型2例，其他类型8例。

1.2 方法 应用免疫组化SABC法和图像分析技术的方法检测30例骨肉瘤组织中ADM和整合素αvβ3的阳性率、表达强度和平均光密度（ALD）。所有骨肉瘤标本均经4%多聚甲醛固定，脱水，常规石蜡包埋后，行4mm厚连续切片。先从各组中取一张行HE染色确认诊断后，其余切片再行免疫组化法检测。使用的两种抗体分别为：兔抗人ADM单克隆抗体（稀释度为1∶250，ABCAM公司）、鼠抗人整合素αvβ3单克隆抗体（稀释度为1∶300，ABCAM公司）。SABC免疫组化试剂盒及其他试剂均购于北京中杉公司。操作步骤按试剂盒说明书进行检测，以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为空白对照。

1.3 判定标准 每张切片分别由两名病理医师在未知临床和病理资料的情况下独立观察切片，随机观察（至少5个具有代表性的高倍视野，计数100个细胞），判定肿瘤分期、分级及细胞染色程度。根据染色程度及染色细胞百分率进行分析评分：（1）基本不着色者为0分，着色淡者为1分，着色适中者为2分，着色深者为3分；（2）着色细胞占计数细胞百分率，≤5%为0分，＞5%～25%为1分，＞25%～50%为2分，＞50%为3分。再将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分相加，为其最后得分：0～1分为阴性（－）；＞1～4分弱阳性（＋）；＞4～6分中阳性（＋＋）；＞6分为强阳性（＋＋＋）。在每张切片的高倍视野（×400）下随机选取5个不同视野，将所见视野输入计算机，经全自动医学彩色图像分析系统析处理，得到5个视野的ADM与整合素αvβ3的ALD。ALD值越大，说明目的蛋白的表达水平越高。

1.4 统计学处理 所有的统计分析采用SPSS18.0进行处理，计量资料以表示，计数资料以频数及百分率表示。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较行q检验，计数资料多组间用χ2检验进行分析，ADM与整合素αvβ3的关系采用Spearman秩相关分析。检验水准＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ADM和整合素αvβ3表达的阳性率 ADM和整合素αvβ3表达的阳性率与骨肉瘤患者的性别、年龄、原发部位、FNCLCC肿瘤分级、GTM分期及Dahlin′s组织学分型之间差异无统计学意义（P＞0.05），而与肿瘤的体积大小、肿瘤是否转移差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 ADM和整合素αvβ3在骨肉瘤组织中的表达 镜下观察ADM与整合素αvβ3的阳性染色均呈棕黄色或棕褐色，二者染色主要定位于细胞膜和细胞质。ADM和整合素αvβ3的表达强弱与骨肉瘤不同分期之间差异有统计学意义（P＜0.05），其表达强度随着骨肉瘤分期的上升而逐渐增加。见图1、2，表2、3。

表1 骨肉瘤患者一般资料（n）

表2 ADM表达强度与骨肉瘤分期的关系

表3 整合素αvβ3表达强度与骨肉瘤分期的关系

图1 ADM在不同分期骨肉瘤中的表达情况（SABC法，×200）

图2 整合素αvβ3在不同分期骨肉瘤中的表达情况（SABC法，×200）

2.3 ADM和整合素αvβ3在骨肉瘤组织中ALD的表达 结果发现其ALD数值也随着肿瘤分期上升而逐渐增高，且在不同分期之间的差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 ADM与整合素αvβ3在不同分期骨肉瘤组织中ALD表达（s）

表4 ADM与整合素αvβ3在不同分期骨肉瘤组织中ALD表达（s）

分期 n ADM 整合素αvβ3Ⅱa期6 0.038 13±0.014 45 0.031 12±0.015 32Ⅱb期 11 0.060 21±0.012 68 0.047 58±0.016 22Ⅲ 期 11 0.078 91±0.024 38 0.062 35±0.025 78Ⅳ 期2 0.096 02±0.032 01 0.086 09±0.021 90

2.4 ADM与整合素αvβ3表达的相关性 应用Spearman直线相关法计算两者在不同分期骨肉瘤组织中表达的相关性，求得相关系数为r＝0.817，P＜0.01。二者的表达变化水平呈正相关关系。

3 讨 论

3.1 骨肉瘤的分期标准 骨与软组织肉瘤的种类繁多，治疗方式也与其病理类型密切相关，但真正影响治疗决策的则是肉瘤分期，它直接决定了是否应该进行放化疗或手术。Enneking临床分期法虽然可以对骨肉瘤做出大概的分期，主要是用来评估患者群体的治疗效果，但对每个患者制订手术治疗方案的帮助并不大［5］。而2010年制定的AJCC分期系统是依据肿瘤的组织学分级（G）、肿瘤大小（T）、淋巴结状态（N）和有无远处转移（M）进行分期的。其中，后三者的评判标准都非常明确，但对于组织学分级的标准仍存在争议［6－8］。而FNCLCC分级法则是依据肿瘤的分化程度、有丝分裂计数和肿瘤坏死程度对肿瘤进行量化地分级评定，是对AJCC法分级标准的量化和补充。本实验将两种标准结合在一起使用，可以从宏观和微观的角度判断骨肉瘤的分级和分期，有助于制定下一步的个体化治疗方案。

3.2 ADM和整合素αvβ3与骨肉瘤的关系 侵袭和转移是骨肉瘤重要的恶性生物学行为之一，是一个极其复杂的过程，主要包括：原发癌肿瘤细胞的大量增殖、肿瘤血管生成、瘤细胞脱落并侵入基质、进入脉管系统和瘤细胞在转移组织、器官上的定位生长。这其中每一步都包含着多种细胞因子及多种细胞信号传导通路的复杂调节作用。ADM可作为循环激素、旁分泌激素及自分泌激素参与体内多种生理、病理过程［9］。且在多种肿瘤中高表达，表现出强大的抑制肿瘤细胞凋亡和参与新生血管形成的能力，能够促进肿瘤细胞增殖和血管生成，缓解肿瘤内部相对缺氧的环境，有利于肿瘤的局部浸润和转移［10］。前期研究也发现，ADM在骨肉瘤组织中的表达水平明显高于正常组织，且在患者血浆中的水平也明显高于健康人，尤其是转移组的血浆水平更是远高于未转移组［11］。后来又发现ADM可以通过上调血管内皮生长因子（VEGF）的表达而参与新生血管的生成，促进肿瘤发展，且沉默ADM基因后，VEGF的表达降低，裸鼠的瘤体增殖也受到明显抑制。

而整合素αvβ3作为肿瘤细胞上的一类受体，在正常骨组织中不表达或表达程度很低，但在骨肉瘤中表达明显，也随骨肉瘤恶性程度增加而增高［12］。可与Ⅰ、Ⅳ型胶原、LM、FN、纤维蛋白原等结合，增加瘤细胞的异质黏附力，参与细胞内外信息的传递过程，并在肿瘤的新生血管生成和转移中起了重要的作用［13］。Lakshmikanthan等［14］在研究整合素与肿瘤血管之间关系时发现，整合素αvβ3可以通过多条途径最终激活VEGF信号通路来调控肿瘤血管的生成。Lorger等［15］也发现，整合素αvβ3可以与VEGF受体（VEGFR）发生交联，协同强化VEGF对其受体的激活作用，促进血管的生成，从而促进肿瘤的侵袭转移。因此，整合素αvβ3被认为是在肿瘤中新生血管中一种重要而独立的预后标志。

本实验通过联合采用免疫组化SABC法和测定蛋白ALD的方法，发现了骨肉瘤组织中ADM和整合素αvβ3的表达与患者的性别、年龄、原发部位、GTM分期、FNCLCC肿瘤分级及组织学分型之间差异无统计学意义（P＞0.05），但与肿瘤的体积大小和肿瘤是否转移有关联。还证明了ADM和整合素αvβ3的表达强弱随着骨肉瘤分期的上升逐渐增加，在不同的分期之间差异均有统计学意义（P＜0.05），且二者在不同分期骨肉瘤组织中的表达水平呈正相关。这可能是由于ADM和整合素αvβ3都在肿瘤新生血管的过程中发挥着作用。分析其机制可能是：肿瘤细胞旺盛的增殖能力导致了肿瘤体积地快速增大，而仅靠其渗透作用而来的营养无法满足自身需要，故需要形成大量的新生血管对肿瘤进行营养支持，此外肿瘤细胞还不断分泌各种促进血管生成的细胞因子，如ADM和整合素αvβ3来缓解这种相对缺氧的状态。目前已证实，ADM可抑制细胞的凋亡及促进肿瘤新生血管的产生［10，16］；整合素 αvβ3可参与新生的肿瘤血管内皮细胞的迁移、黏附并形成管形，同时也为肿瘤转移的提供了新通道［17］。

综上所述，ADM和整合素αvβ3在肿瘤的发展过程中均发挥着重要作用，且二者在肿瘤新生血管功能上有着相似的表现，提示二者之间可能存在协同促进作用，共同影响着肿瘤发生和发展。这也为联合检测骨肉瘤中整合素αvβ3与ADM的表达以预测骨肉瘤转移潜能及预后的研究提供了研究方向；对研究ADM和整合素在骨肉瘤中的作用机制及其相互关系，以及对进一步揭示骨肉瘤的转移机理有着重要理论价值。

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