干细胞因子在胰腺星状细胞和肥大细胞黏附中的作用

吴恺 徐刚 徐铭益 王兴鹏

·论著·

干细胞因子在胰腺星状细胞和肥大细胞黏附中的作用

吴恺 徐刚 徐铭益 王兴鹏

目的观察干细胞因子(SCF)在活化胰腺星状细胞(PSC)中的表达以及在PSC与肥大细胞黏附中的作用。方法采用SD大鼠胰腺组织块培养分离活化PSC，应用RT-PCR免疫细胞化学染色法检测PSC的SCF mRNA和蛋白的表达；经不同剂量的抗SCF抗体中和PSC表面SCF，采用β-氨基已糖苷酶测定观察肥大细胞与PSC之间的黏附；PSC经10 μg/ml丝裂霉素C处理后为饲养层细胞，与肥大细胞共培养，硫堇兰染色观察培养后2、3、5 d的肥大细胞生长情况。结果活化的PSC表达SCF mRNA和蛋白。对照组、1 mg/ml 和10 mg/ml抗体处理组黏附的肥大细胞量分别为每视野(48±10)个、(28±8)个和(23±9)个，抗体组较对照组明显减少(Plt;0.05)。1 mg/ml 和10 mg/ml抗体组的肥大细胞黏附率分别为(53±3)%和(45±5)%。PSC和肥大细胞在无血清条件下共培养1 d后，PSC有肥大细胞黏附；共培养3 d后黏附的数量增加；5 d后呈堆积状，有较多集落形成，PSC基本消失。结论活化的PSC可合成分泌SCF，引起肥大细胞的黏附和生长。

干细胞因子； 胰腺； 星形细胞； 肥大细胞

近年来研究发现,肥大细胞不仅是Ⅰ型变态反应的主要免疫细胞，还参与慢性炎症及纤维化的过程。在慢性胰腺炎胰腺纤维化组织中有胰腺星状细胞(pancreatic stellate cell，PSC)的活化，同时肥大细胞数量明显增加，并表现为特征性慢性脱颗粒[1]，但在胰腺纤维化过程中活化的PSC是否参与肥大细胞的趋化及生长尚不明了。干细胞因子(stem cell factor，SCF)是肥大细胞趋化和生长的必需因子。因此，本实验观察活化的PSC中SCF的表达以及对肥大细胞黏附和生长的影响。

材料与方法

一、肥大细胞

肥大细胞株(RBL-2H3)由本院检验科李莉主任惠赠，培养于含10%小牛血清的DMEM高糖培养基(Gibco公司)，每3 d传代一次。

二、胰腺星状细胞分离

雄性SD大鼠，购自中科院动物中心，体重300 g左右。无菌条件下取胰腺组织，灭菌D-Hanks溶液漂洗去除血液后，剪成约1 mm3的小块，平铺于塑料培养皿中，先后滴加无菌大鼠血浆及氯化钙，形成纤维包裹层，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2孵育培养，每2 d更换培养液。2 d后见组织块周围有PSCs移出，待PSC达到一定数量后剔除组织块，继续培养24 h，胰酶消化传代，3～6代PSC用于实验。

三、SCF蛋白表达的检测

采用细胞免疫化学法。PSC接种于玻璃爬片，常规培养24 h，取出后用冰冷无水甲醇固定20 min，PBS洗涤后滴加兔抗大鼠SCF多克隆抗体(1∶100，购自武汉博士德生物公司)4℃过夜，PBS洗涤后滴加即用型HRP标记二抗(长岛生物技术公司)室温孵育30 min，PBS洗涤后DAB显色，苏木素复染后中性树胶封片。胞质出现棕黄色颗粒为阳性。

四、SCF mRNA的检测

采用RT-PCR方法。收集PSC细胞，采用Trizol试剂盒抽提细胞总RNA，SCF引物序列为5′-GCT-ACCCAATGCTGGGACTA-3′和5′-GCCACGAGGTCA-TCCACTAT-3′，退火温度为56℃，扩增片段为456 bp，以GAPDH为内参照。扩增产物电泳后采用GeneGenius凝胶成像系统进行观察分析。

五、肥大细胞黏附实验

PSC接种于96孔培养板，待细胞长满后充分洗涤，添加含1、10 mg/ml的SCF IgG的无血清培养基，对照组加入非免疫型IgG，每个浓度重复4孔。培养3 h后弃去培养基，每孔加入1×104肥大细胞，继续培养1 h，然后用无血清培养基轻轻洗涤3次，去除未黏附的肥大细胞。随机选取5个视野计数PSC细胞表面黏附的肥大细胞数量。

六、β-氨基己糖苷酶(β-hexasaminidase)测定

β-氨基己糖苷酶是肥大细胞中特有的酶类，其活性的高低反映肥大细胞的数量以及颗粒分泌的情况。参考文献[2]方法检测。同上述黏附实验操作，以单纯1×104肥大细胞作对照。用100 μl细胞裂解液裂解细胞，吸取25 μl细胞裂解液和100 μl 1.2 mmol/L的4-methyllumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminidase(溶于0.05 mol/L醋酸钠溶液，pH4.4)于96孔板，37℃反应30 min，加入175 μl 0.1 mol/L甘氨酸-碳酸盐缓冲液(pH10.0)，混匀后在荧光酶标仪检测。激发波长为360 nm，淬灭波长为450 nm。肥大细胞黏附率=样品管A值/对照组A值×100%。

七、PSC对肥大细胞生长影响的观察

PSC接种于24孔培养板，待70%～80%细胞融合时加入10 μg/ml的丝裂霉素C，37℃孵育3 h，用PBS洗涤细胞6次充分洗去丝裂霉素C，制备PSC饲养层细胞。培养24 h后加入2×104肥大细胞，采用无血清化培养基培养。培养后第2、3、5天用硫堇兰染色，观察肥大细胞(呈紫红色)的生长情况。

八、统计分析

结 果

一、活化PSC的SCF mRNA和蛋白的表达

分离培养的活化PSC细胞呈梭形，活化的PSC表达SCF mRNA和蛋白(图1)。

图1活化PSCs的SCF mRNA(A )和蛋白(B，免疫化学染色 ×200)表达

二、PSC和肥大细胞之间的黏附

镜下肥大细胞呈圆形或椭圆形，散在黏附于PSC表面，对照组和1 mg/ml、10 mg/ml抗体组黏附的肥大细胞量分别为每视野(48±10)个、(28±8)个和(23±9)个，抗体组较对照组明显减少(Plt;0.05)。β-氨基已糖苷糖酶测定的肥大细胞黏附率，1、10 mg/ml抗体组分别为(53±3)%、和(45±5)%。

三、PSC对肥大细胞生长的影响

肥大细胞在无血清的培养基中培养1 d后有大量细胞漂浮，只能维持存活2 d。经丝裂霉素C处理后的PSC饲养层细胞，具有无法增殖、可维持细胞正常生理活性等特点，并在5～7 d后死亡消失。PSC和肥大细胞在无血清条件下共培养1 d后，PSC有肥大细胞黏附存活，培养液中有肥大细胞悬浮；3 d后黏附的肥大细胞数量增加，而PSC和悬浮的肥大细胞数量减少；5 d后肥大细胞呈堆积状，有较多集落形成，PSC基本消失，仅有零星散在分布(图2)。

图2PSC和肥大细胞共培养1(A)、3(B)、5 d(C)的细胞生长情况(×100)

讨 论

近年研究发现，肥大细胞不仅参与局部的免疫反应，在慢性炎症及组织纤维化中也发挥一定的作用，其颗粒成分诸如类胰蛋白酶(tryptase)、类糜蛋白酶(chymase)及肝素等均可刺激成纤维细胞和肝星状细胞胶原合成增加，在肝脏、肾脏等组织纤维化中均有肥大细胞数量的增加且与纤维化程度呈正相关[3-4]。胰腺纤维化过程中主要效应细胞PSC的持续活化增殖是关键。在胰腺纤维化组织中有肥大细胞的聚集和慢性脱颗粒，且主要分布在PSC周围，推测活化的PSC可能参与了肥大细胞的聚集和脱颗粒过程。

肥大细胞来源于骨髓，在外周血发育成熟并分布于脏器的间质中，数量和分布相对稳定。SCF是肥大细胞发育成熟以及组织趋化定位的主要介质，通过与肥大细胞表面的SCF受体(c-kit)发挥生物学效应，SCF分为可溶性和膜结合型两大类，可溶性SCF主要影响肥大细胞的成熟及趋化，而膜结合型参与细胞之间的黏附接触。此外，肥大细胞胞膜表面有特异性生精免疫球蛋白超级家族(spermatogenic immunoglobulin superfamily, SgIGSF)表达。不表达c-Kit和SgIGSF的肥大细胞株IC-2转染c-Kit和SgIGSF基因后，其与成纤维细胞的黏附量明显高于单独转染c-Kit基因的细胞，而单独转染SgIGSF基因则黏附作用未见增强，提示SCF/c-Kit可能是肥大细胞黏附作用的主要启动因素，对其他参与因素具有引导作用[5]。本实验结果显示，活化的PSC表达SCF mRNA和蛋白，经抗SCF抗体中和后，肥大细胞黏附于PSC的数量明显减少，在1 μg/ml以上抗体中和后，肥大细胞的黏附率维持在50%左右，呈现一个平台期，提示除SCF/c-Kit系统外还存在其他黏附分子参与细胞间的黏附过程。

SCF对肥大细胞的生长具有重要意义。原代肥大细胞体外培养条件下无法长期存活，然而在SCF和IL-1持续刺激下可存活2～3周。Sellge等[6]在人肠道原代成纤维细胞(FB)和原代肥大细胞的共培养研究中发现，肥大细胞在FB存在的条件下可存活至3周，远长于肥大细胞单独培养条件下的3～4 d的存活时间，推测肥大细胞释放的颗粒成分作用于FB产生SCF，SCF刺激肥大细胞的生长，形成相互刺激作用。本研究采用丝裂霉素C抑制PSC的生长，制备成饲养细胞，与肥大细胞共培养后，肥大细胞黏附于PSC并生长，推测胰腺纤维化过程中活化PSC表达的SCF诱导肥大细胞趋化黏附并生长，而肥大细胞的颗粒成分维持PSC的活化，加速纤维化的形成。

[1] 吴恺，张汝玲，王兴鹏.肥大细胞在胰腺纤维化中的介导作用.胰腺病学,2003,3:129-131.

[2] Naal RM, Tabb J,Holowka D,et al.In situ measurement of degranulation as a biosensor based on RBL-2H3 mast cells. Biosen Bioelectron,2004,20:791-796.

[3] Armbrust T, Batusic D, Ringe B, et al. Mast cells distribution in human liver disease and experimental rat liver fibrosis. Indications for mast cell participation in development of liver fibrosis. J Hepatol, 1997,26:1042-1054.

[4] Otsubo S,Nitta K,Uchida K,et al.Mast cells and tubulointerstitial fibrosis in patients with ANCA-associated glomerulonephritis. Clin Exp Nephrol,2003,7:41-47.

[5] Koma Y,Ito A, Watabe K,et al.Distinct role for c-kit receptor tyrosine kinase and SgIGSF adhesion molecule in attachment of mast cells to fibroblasts.Lab Invest,2005,85:426-435.

[6] Sellge G,Lorentz A,Gebhardt T,et al.Human intestinal fibroblasts prevent apoptosis in human intestinal mast cells by a mechanism independent of stem cell factor, IL-3, IL-4, and nerve growth factor.J Immunol,2004,172: 260-267.

2008-12-01)

(本文编辑：吕芳萍)

Effectofonadhesionbetweenpancreaticstellatecellandmastcell

WU Kai, XU Gang, XU Ming-yi, WANG Xing-peng.

Department of Gastroenterology, Shanghai First People′s Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200080, China

WANGXing-peng,Emailwangxp1965@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate stem cell factor (SCF) expression in activated pancreatic stellate cell (PSC) and the effect of SCF on adhesion between PSC and mast cell (MC).MethodsPSC of SD rat was separated and activated by pancreatic tissue culture; the expression of SCF mRNA and protein was detected by RT-PCR and immunochemistry. SCF was blocked with different dose of anti-SCF antibody, the rate of adhesion between PSC and MC was determined by thionin blue stain and β-hexasaminidase assay. PSC was stimulated by 10 μg/ml mitomycin-C and was co-cultured with MC, then the growth of MC was observed at 2, 3, 5 day, respectively.ResultsActivated PSC expressed SCF mRNA and protein, the number of adhered MC in the control, 1 mg/ml and 10 mg/ml antibody groups was 48±10, 28±8, and 23±9, respectively; the difference between antibody and control group was statistically significant (Plt;0.05). One day after PSC and MC was co-cultured without serum, there were MC adhesion; 3 days later the rate of adhesion increased; 5 days later the adhesion appeared bulk-like and lots of colonies were present, while PSC basically disappeared.ConclusionsActivated PSC may synthesize, express SCF and induced adhesion and growth of MC.

Stem cell factor; Pancreas； Astrocytesl; Mast cells

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.010

上海市卫生局课题资助(024016)

200080 上海，上海交通大学附属第一人民医院消化科(吴恺、徐刚、徐铭益、王兴鹏)；同济大学附属第十人民医院(王兴鹏)

王兴鹏，Email: wangxp1965@yahoo.com.cn