MUC2基因甲基化在胰腺癌细胞株、胰腺癌患者外周血中的检测及意义

薄陆敏 李兆申 高军 龚燕芳 吴红玉 金晶

·论著·

MUC2基因甲基化在胰腺癌细胞株、胰腺癌患者外周血中的检测及意义

薄陆敏 李兆申 高军 龚燕芳 吴红玉 金晶

目的检测MUC2基因在胰腺癌细胞株、胰腺癌患者外周血中的甲基化情况，探讨MUC2基因甲基化对胰腺癌早期诊断的价值。方法收集长海医院消化内科实验室保存的人胰腺癌细胞系SW1990、ASPC、PANC1、BxPC3、PaTu8988、CFPAC1及40例胰腺癌、15例慢性胰腺炎患者和25例正常对照者外周血标本，应用甲基化敏感性限制性内切酶(methylation-sensitive restriction endonuclease，MS-RE)为基础的PCR法检测MUC2基因甲基化。结果人胰腺癌细胞系PANC1、BxPC3、PaTu8988未发生MUC2基因甲基化；ASPC、CFPAC1、SW1990胰腺癌细胞系发生MUC2基因甲基化。外周血标本中，40例胰腺癌标本甲基化率为40.0%(16例)，15例慢性胰腺炎无甲基化，25例正常对照甲基化率4.0%(1例)。胰腺癌与慢性胰腺炎、正常对照之间的甲基化率有显著差异(Plt;0.01)。外周血标本MUC2基因启动子CpG岛甲基化检测诊断胰腺癌的敏感性为40%、特异性为97.5%、诊断准确性68.8%、阳性预测值94.1%、阴性预测值61.9%。结论用甲基化限制性酶切PCR法对外周血进行MUC2基因启动子区高甲基化检测可望成为新的胰腺癌诊断的重要实验室辅助手段。

胰腺肿瘤； 甲基化； MUC2基因； 聚合酶链反应

近年来DNA甲基化成为肿瘤研究的热点，它是人类后成论学说的主要复制后修饰方式[1-2]，通常发生在胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG二核苷酸中的胞嘧啶5位碳原子上。MUC2属于分泌型粘蛋白，在多种肿瘤，包括胰腺癌中异常表达，这与其启动子区CpG岛高甲基化相关。有研究显示，结直肠癌细胞中MUC2表达抑制与基因启动子区CpG岛高甲基化相关[3-5]。本实验分析胰腺癌细胞株、胰腺癌患者外周血中MUC2基因的甲基化情况，探讨其对胰腺癌临床诊断的价值。

材料与方法

一、胰腺癌细胞系

SW1990购于美国ATCC公司，ASPC、BxPC3、CFPAC1、PANC1购自中国科学院细胞所，PaTu8988由德国Marburg市Philipps大学细胞生物学和分子病理学研究所Elsasser博士惠赠。常规培养传代。收集细胞，采用酚/氯仿法抽提细胞DNA。

二、外周血标本

取自2006年5月至2006年11月第二军医大学附属长海医院住院的胰腺癌患者40例，慢性胰腺炎(CP)患者15例。胰腺癌中29例由病理学诊断为导管腺癌，11例经临床表现、实验室检查、影像学MRI及ERCP检查等确诊，其中男24例，女16例，年龄38～79岁，平均53.2岁。CP诊断参照慢性胰腺炎诊治指南(2005年，南京)的标准，其中男10例，女5例，年龄36～68岁，平均48.6岁。25例正常对照来自长海医院消化内科(均排除其他肿瘤疾病)。所有病例均有较完整的临床资料。

将1 ml EDTA抗凝血加入1 ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)，3500 g离心15 min,倾去含裂解红细胞上清，重复一次；用0.7 ml TE混悬沉淀物，37℃水浴温育1 h；加入1 mg/ml蛋白酶K 0.2 ml,上下转动试管。待液体变黏稠后置50℃水浴保温3 h，酚/氯仿法抽提DNA。

三、MUC2基因甲基化检测

抽提的DNA采用DNA纯化试剂盒(上海天根生物科技公司)纯化，分别应用HpaII、MSPI酶切。酶切反应体系：模板DNA 0.5 μl/100 ng，10×T Buffer 3 μl，0.1% BSA 3 μl，HindⅢ 1 μl，MspI/HpaⅡ 2 μl/20U，ddH2O 20.5 μl。置37℃ 水浴 4 h，75℃ 20 min终止反应，普通DNA纯化试剂盒进行纯化，洗脱液EB 20 μl洗脱DNA，-20℃保存。设未经酶切的DNA作为对照，根据JENNY J等设计的引物序列，由上海生物工程公司合成。MUC2引物上游：5′-TGTGTTGGCATTCAGGCTAC-3′，下游：5′-GCAGGGGCGGTGTGGGTT-3′，扩增片段259 bp。PCR扩增反应条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s、61℃ 40 s、72℃ 40 s，30个循环；最后72℃ 10 min。PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳。

HpaⅡ为甲基化敏感酶，不能识别甲基化的CmCGG序列；MspI为甲基化非敏感酶，可识别甲基化的CmCGG序列。PCR扩增后出现259 bp条带时为MUC2基因启动子甲基化，反之则为非甲基化。

四、统计学处理

SPSS软件包处理数据，Fisher精确检验计算P值，Plt;0.05为差异有显著性。

结 果

一、胰腺癌细胞株MUC2基因甲基化状态

所有胰腺癌细胞株未经MspⅠ/HapⅡ限制性酶切前均可扩增出259 bp大小的条带。经甲基化非敏感性酶MspⅠ酶切后，特异性PCR产物均消失。PANC1、BxPC3、PaTu8988经甲基化敏感性酶HapⅡ酶切后，特异性PCR产物消失，表明MUC2基因未发生甲基化；ASPC、CFPAC1、SW1990经HapⅡ酶切后仍可扩增出259 bp大小的条带，表明MUC2基因发生甲基化(图1)。

二、胰腺癌患者外周血MUC2基因甲基化状态

40例胰腺癌患者血标本的MUC2基因甲基化率为40.0%(16/40)，15例CP患者血MUC2基因无甲基化，25例正常对照者的血MUC2基因甲基化率为4.0%(1/25)。胰腺癌与CP、正常对照组之间的MUC2基因甲基化率有显著差异(Plt;0.01，图2)。外周血标本MUC2基因启动子CpG岛甲基化检测诊断胰腺癌的敏感性为40%、特异性为97.5%、诊断准确性68.8%、阳性预测值94.1%、阴性预测值61.9%。以CA19-9gt;37 μ/ml诊断胰腺癌，则诊断的敏感性为65.0%、特异性为85%、诊断准确性75%、阳性预测值81.3%、阴性预测值70.8%。外周血标本MUC2基因甲基化检测与CA19-9相比，可提高诊断的特异性和阳性预测值，而在诊断敏感性和准确性方面无显著差异。

讨 论

由于胰腺癌在临床上缺乏特异表现，影像学检查和肿瘤标记物如CA19-9又很难在早期发现肿瘤，就诊时3/4的患者已属晚期，手术可切除率仅为4%～27%，5年生存率小于5%。因此，发展新的筛选手段、综合分析高危人群和提高胰腺癌的早期诊断率，是改善预后的关键。

C：未酶切的扩增条带；M：经MspⅠ酶切后的扩增条带；H：经HapⅡ酶切后的扩增条带

图16株胰腺癌细胞株MUC2基因甲基化的检测结果

M： marker；C：未经酶切的扩增条带；M：经MspⅠ酶切后的扩增条带；H：经HapⅡ酶切后的扩增条带

图26例胰腺癌患者血MUC2基因甲基化扩增产物图

生理状态下，DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育过程中起着极其重要的作用。甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素。目前肿瘤的基因甲基化研究主要集中在抑癌基因，这是因为人们发现肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化有关。由于CpG岛发生甲基化早于细胞的恶性增生，因此甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测[6]。

DNA甲基化的检测可分为基因组整体水平的甲基化检测、特异位点的甲基化检测和新甲基化位点的寻找；检测方法可分为基于PCR的甲基化分析方法、基于限制性内切酶的甲基化分析方法、基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法和柱层法等。本课题采用以甲基化敏感性限制性内切酶(methylation-sensitive restriction endonuclease，MS-RE)为基础的PCR法，是对特异性位点的DNA甲基化的检测。这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不识别的特性，将DNA消化为不同大小的片段后再进行分析。HpaⅡ和MspⅠ均能识别CCGG序列，然而当序列中的胞嘧啶发生甲基化时，HpaⅡ不识别，利用HpaⅡ-MspⅠ的这种属性处理DNA，随后进行PCR扩增分离产物，明确甲基化状态[7]。这是一种经典的甲基化研究方法，其优点是简单,成本低廉，甲基化位点明确,实验结果易解释，但也同时存在着酶不完全消化引起的假阳性的问题。本课题采用非待测区的内切酶HindⅢ和甲基化敏感的限制性内切酶HapⅡ同时消化DNA片段，随后通过DNA片段纯化，保留了含有甲基化区的片段，从而避免了MS-RE不完全消化引起的假阳性的问题。

MUC2属于分泌型粘蛋白，我们前期的研究显示人胰腺癌细胞系MUC2表达抑制与其启动子区CpG岛发生高甲基化相关。本课题通过检测外周血标本，显示胰腺癌与CP、正常对照之间的MUC2基因甲基化存在显著性差异(Plt;0.01)。外周血标本MUC2基因甲基化检测诊断胰腺癌与CA19-9相比，可提高诊断的特异性和阳性预测值。因此，外周血MUC2基因甲基化检测有可能成为胰腺癌临床诊断的一种实验室辅助手段。

[1] Baylin SB,Herman JG,Graff JR,et al.Alterations in DNA methylation:a fundamental aspect of neoplasia.Adv Cancer Res,1998,72:141-196.

[2] Baylin SB.Reversal of gene silencing as a therapeutic target for cancer-roles for DNA methylation and its interdigitation with chromatin.Novartis Found Symp,2004,259:226-233.

[3] Hanski C,Riede E,Gratchev A,et al.MUC2 gene suppression in human colorectal carcinomas and their metastases:in vitro evidence of the modulatory role of DNA methylation.Lab Invest,1997,77:685-695.

[4] Riede E,Gratchev A,Foss HD,et al.Increased methylation of promotor region suppresses expression of MUC2 gene in colon carcinoma cells.Langenbecks Arch Chir Suppl Kongressbd,1998,115:299-302.

[5] Gratchev A,Siedow A,Bumke-Vogt C,et al.Regulation of the intestinal mucin MUC2 gene expression in vivo:evidence for the role of promoter methylation.Cancer Lett,2001,168:71-80.

[6] Bird AP.CpG-rich islands and the function of DNA methylation.Nature,1986,321:209-213.

[7] Eads CA,Danenberg KD,Kawakami K,et al.MethyLight:a highthroughput assay to measure DNA methylation.Nucleic Acids Res,2000,28:E32.

2009-05-04)

(本文编辑：屠振兴)

MethylationstatusofMUC2geneinpancreaticcarcinomacelllinesandperipheralbloodofpancreaticcarcinomapatients

BO Lu-min, LI Zhao-shen, GAO Jun, GONG Yan-fang, WU Hong-yu, JIN Jing.

Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

LIZhao-Shen,Emailzhsli@81890.net

ObjectiveTo analyze the methylation status of MUC2 gene in pancreatic carcinoma cell lines and peripheral blood of pancreatic carcinoma patients, and to explore the role of MUC2 methylation in the early diagnosis of pancreatic carcinoma.MethodsHuman pancreatic cancer cell lines of SW1990, ASPC, PANC1, BxPC3, PaTu8988 and CFPAC1, and 40 peripheral blood samples of pancreatic carcinoma patients, 15 cases of chronic pancreatitis, 25 cases of normal controls were collected, and the methylation status of MUC2 gene was detected by methylation sensitive restriction endonuclease PCR.ResultsMUC2 methylation was not detected in PANC1, BxPC3, PaTu8988, but was detected in ASPC, CFPAC1, SW1990. Among the peripheral blood samples, the rate of methylation in pancreatic cancer was 40.0% (n=16), in chronic pancreatitis was 0%, in normal controls was 4.0% (n=1), and the difference among the three groups was statistically significant (Plt;0.01). The methylation of MUC2 gene CpG islands for the diagnosis of pancreatic carcinoma had a sensitivity of 40%, specificity of 97.5%, accuracy of 68.8%, positive predictive value of 94.1% and negative predictive value of 61.9%．ConclusionsThe detection of MUC2 hypermethylation in peripheral blood samples may be an potential marker for early diagnosis of pancreatic carcinoma.

Pancreatic neoplasms; Methylation; MUC2 genes; Polymerase chain reaction

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.014

200433 上海，第二军医大学长海医院消化内科

李兆申：Email:zhsli@81890.net