己酮可可碱对小鼠酒精性肝病酒精代谢酶和核受体PPAR-α的影响*

屈耀宁，董 蕾，史海涛，秦 斌，刘亚萍

因大量饮酒导致的酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）在西方国家是导致死亡的主要疾病之一[1]。在我国，ALD的发病也呈逐渐增长的趋势。据调查，1982年我国成人嗜酒者为0.21%，1991年北京市16个县区调查结果为14.3%，2000年浙江地区调查结果为14.8%，西安地区饮酒者占35.1%[2]。乙醇在肝内通过细胞质乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH)、微粒体细胞色素 P4502E1（CYP2E1）和过氧化物酶代谢，其中ADH和CYP2E1是乙醇代谢的主要酶类[3]。乙醇在肝内代谢主要通过胞浆中ADH途径和内质网的微粒体乙醇氧化系统（MEOS）途径，生成乙醛，再经过乙醛脱氢酶生成乙酸，代谢为水和二氧化碳。在MEOS途径中CYP2E1活化产生的活性氧基团（ROS）是损伤肝脏的主要原因之一[4]。过氧化物酶增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPAR-α）是近年来广泛研究的调控脂肪酸转化和氧化的核转录因子[5]，能有效地调控炎性因子的表达及氧化应激反应，参与酒精性肝损伤的发展过程并发挥关键性作用。目前，关于己酮可可碱（pentoxifylline，PTX）对ALD的治疗作用研究已有报道，但大多仅限于临床观察，很少涉及作用机制方面的研究。为了进一步探讨PTX对ALD的防治作用，我们制备了酒精诱导的C57BL/6小鼠ALD模型，检测小鼠血清 ADH、CYP2E1酶活性和肝组织 ADH、CYP2E1、PPAR-α mRNA水平，以及肝组织CYP2E1和PPAR-α蛋白表达，以探讨PTX对ALD的作用。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级雌性C57BL/6小鼠64只，体质量（20±4）g，由我校动物中心提供。室温保持在（22±2）℃，相对湿度为65%，按正常昼夜节律调整光照时间。

1.2 急性酒精性肝损伤模型的制备 取28只小鼠，随机分为模型组、治疗组和正常组，每组8～10只。治疗组动物提前7天给予PTX（Sigma公司 P1784-10G）100 mg·kg-1体质量腹腔注射，1次/d；模型组和正常组动物给予等量0.9%生理盐水腹腔注射。7天后，给予模型组和治疗组动物50%乙醇12 ml·kg-1体质量灌胃，q12h，连续3次[6]；给予正常组等量5%葡萄糖溶液灌胃。在灌胃结束后，随机处死模型组动物2只，取肝组织行病理学检查。在光镜下见肝小叶大量炎细胞浸润，并有空泡和肝细胞坏死，证明模型建立成功。

1.3 慢性酒精性肝炎模型的制备 取36只小鼠，随机分为模型组、小剂量、大剂量治疗组和正常组，每组8～10只。分别给予治疗组动物PTX 50 mg·kg-1体质量和150 mg·kg-1体质量腹腔注射，1次/d，给予模型组和正常组等量0.9%生理盐水腹腔注射。2 h后，给予模型组、小剂量和大剂量治疗组动物10%乙醇10 ml·kg-1体质量灌胃，1次 /d，1周后，给予20%乙醇 10 ml·kg-1体质量灌胃，1次 /d，参考文献[7]，给予正常组等量5%葡萄糖溶液灌胃，造模及给药时间均为6周。6周后，随机处死模型组动物2只，行病理学检查证明模型建立成功。造模及给药结束后，小鼠禁食不禁水12 h，眼球采血，分离血清，保存于-20℃。采取脱臼法处死小鼠，取肝脏右叶于无菌冻存管，经液氮罐转移至-80℃冰箱保存。取肝左叶置于甲醛液中固定，行病理学检查。

1.4 血清ADH和CYP2E1活性测定 采用比色法检测（南京建成科技有限公司提供试剂，批号A083-1 GMS18021.1）。

1.5 肝组织 ADH、CYP2E1和 PPAR-α mRNA水平测定 取肝组织块各约5 mg，用试剂盒RNAfast200（上海飞捷生物技术有限公司 Catalog no.220010）提取总RNA,采用反转录试剂盒（TaKaRa Biotechnology）反转录为cDNA。由北京鼎国昌盛生物技术公司设计并合成引物（表1）。mRNA水平和对照组无明显差异（P>0.05）；在急性和慢性酒精性肝炎小鼠肝组织CYP2E1 mRNA水平明显增高，与对照组相比有显著性差异（P<0.01），而治疗组比模型组明显降低（P<0.01）；在急性酒精性肝炎、治疗组和对照组小鼠肝组织PPAR-α mRNA水平无显著性差异（P>0.05），慢性酒精性肝炎小鼠肝组织PPAR-α mRNA水平降低，与对照组相比有统计学意义（P<0.05，图1、2）。

表1 引物序列

图1 急性肝损伤小鼠肝组织ADH、CYP2E1和PPAR-αmRNA水平

1.6 肝组织CYP2E1和PPAR-α蛋白表达检测 采用免疫组化法。经过脱蜡、抗原修复、封闭、加一抗（1:100，博士德生物 BA1774 BA1691），4°过夜，加二抗（中杉金桥SP-9000/9001/9002），显色，苏木素复染、封片。阳性染色细胞为胞浆和/或胞膜出现黄褐色物质。

1.7 统计学处理 采用SPSS18.0统计学软件，计量资料以（±s）表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05为有统计学差异，P<0.01为有显著性统计学差异。

2 结果

2.1 小鼠血清ADH和CYP2E1活性变化 见表2。

表2 各组小鼠血清ADH和CYP2E1活性(U/ml，±s）比较

表2 各组小鼠血清ADH和CYP2E1活性(U/ml，±s）比较

与对照组比，①P＜0.05；②P＜0.01

数量 ADH CYP2E1急性肝炎 811.2±1.612.2±1.8①治疗组 811.5±1.28.1±1.5对照组 812.5±1.27.9±1.4慢性肝炎 85.8±1.4① 11.8±1.7②小剂量PTX 86.9±2.6② 10.2±1.5大剂量PTX 84.6±1.77.8±1.5①对照组 84.3±0.66.5±1.2

2.2 肝组织 ADH、CYP2E1和 PPAR-α mRNA水平变化 急性和慢性酒精性肝炎小鼠肝组织ADH

图2 慢性酒精性肝炎小鼠肝组织ADH、CYP2E1和PPAR-αmRNA水平

2.3 肝组织CYP2E1和PPAR-α蛋白表达变化 采用Image-Pro Plus6.0图像处理软件计算阳性细胞表达量，结果在急性和慢性酒精性肝炎动物肝组织CYP2E1阳性细胞表达数比对照组明显增多[分别为（765±21）对（308±12）和（682±25）对（305±18），P<0.01]，而大剂量治疗组分别为（521±18）和（418±12），显著低于模型组（P<0.01）；急性和慢性酒精性肝炎动物肝组织PPAR-α阳性细胞表达比对照组明显减少[分别为（322±15）对（721±18）和（262±23）对（689±14），P<0.01]，而大剂量治疗组分别为（548±20）和（725±19），显著高于模型组（P<0.01，图3、4、5和 6）。

图3 急性肝损伤小鼠肝组织CYP2E1蛋白表达 阳性细胞主要位于胞浆，分别呈弥漫或散在分布（SP，40×）A：模型组；B：治疗组；D：对照组

图4 急性肝损伤小鼠肝组织PPAR-α蛋白表达 阳性细胞主要位于胞核，分别呈弥漫或散在分布(SP，40×）A：模型组；B：治疗组；D：对照组

图5 慢性酒精性肝炎小鼠肝组织CYP2E1蛋白表达 阳性细胞主要位于胞浆，分别呈弥漫或散在分布(SP，40×）A：模型组；B：小剂量治疗组；C：大剂量治疗组；D：对照组

图6 慢性酒精性肝炎小鼠肝组织PPAR-α蛋白表达 阳性细胞主要位于胞核，分别呈弥漫或散在分布(SP，40×）A：模型组；B：小剂量治疗组；C：大剂量治疗组；D：对照组

3 讨论

PTX为甲基黄嘌呤化合物，是一种磷酸二酯酶抑制剂[8]，可提高细胞内c-AMP水平。因改善血流变、扩血管、改善细胞缺氧、抗炎、抗氧化和调节免疫等作用[9]，已被证实能预防和改善肝纤维化、肺纤维化、脂肪肝、脑缺血。目前，关于PTX对ALD的作用已有报道，比如疗效的观察等[10～12]，研究表明，PTX确实可以改善ALD患者病情，但对其具体作用机理的研究尚未见报道。我们推测PTX改善ALD的机制可能与ADH无关。

国内外大量研究已经证实，CYP2E1的活化在ALD的发生发展中有着极其重要的作用[13]。

CYP2E1的活化是乙醇导致酒精性肝损伤和肝纤维化的原因[14]。Zanelli等证实，乙醇能够延缓CYP2E1的降解[15]。MEOS是乙醇代谢的另一重要途径，当肝组织中乙醇浓度超过10 mmol/L时，MEOS被激活并对乙醇代谢起主要作用。乙醇在体内代谢产生大量ROS，通过传递电子，氧化大分子物质，引起肝细胞脱氧核糖核酸损伤、蛋白质和脂质氧化损伤[16]。实验中模型组CYP2E1 mRNA和蛋白水平均明显增高，而治疗组显著降低，表明CYP2E1是ALD的一种损伤性蛋白。我们推测，PTX可能减少了乙醇代谢过程中ROS的产生。

PPAR是一类能被配体激活的核转录因子[17]，目前已知有三种亚型，即α、β和γ，在各种组织中表达不同[18]。PPAR-α高表达于线粒体丰富和β氧化活性高的组织。PPAR-β高表达于脂肪组织，PPAR-γ几乎均低表达于各种组织[19]。PPAR-α是近年来广泛研究的调控脂肪酸转化和氧化的核转录因子[20]，还可以调节炎症反应和免疫反应等。大量文献证明PPAR-α缺失或降低会导致肝脏脂肪变和炎症反应。细胞学实验表明，乙醛能够抑制PPAR-α与其DNA和某些配体的结合能力。实验中乙醇暴露后，小鼠肝脏PPAR-α蛋白水平显著降低，PTX治疗增加了PPAR-α蛋白的表达水平，并且在长期乙醇暴露后PPAR-α mRNA水平也降低。这一结果表明，PPAR-α是ALD的一种保护性蛋白，且PTX改善ALD的作用与其对PPAR-α的活化有关。我们推测，PTX可能因其抗氧化作用减少了乙醛的生成量，并且削弱了酒精对PPAR-α及某些脂肪氧化酶表达的抑制，从而阻止了ALD的发生和发展。

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