异氟醚对Aβ25-35诱导大鼠PC12细胞自噬和凋亡的影响

王 伟，朴美花，王艳姝，刘 楠，岳 云，冯春生（.吉林大学第一医院麻醉科，吉林 长春 002；2.吉林省长春市传染病医院麻醉科，吉林 长春 02；.首都医科大学附属北京朝阳医院麻醉科，北京 00020）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又称老年性痴呆，是一种常见的老年神经变性疾病，其病因还不十分清楚，目前尚无有效治疗措施。研究[1－3]发现：自噬与AD的发病机制密切相关，自噬障碍能引起β淀粉样蛋白（beta-amyloid protein，Aβ）产生增加，诱导神经元凋亡，进而促进AD发病。目前流行病学调查研究[4－6]表明：麻醉药物和一些外科手术也是AD的诱发因素，能够增加AD发病的风险。有研究[7－8]发现：临床常用的吸入麻醉药异氟醚能增加Aβ产生，诱导细胞凋亡，加重AD病理过程，但其促进AD发病的机制是否与抑制自噬有关尚不清楚。因此，本研究拟应用Aβ25-35损伤的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞）体外AD模型，研究异氟醚对Aβ25-35诱导的大鼠PC12细胞自噬和凋亡的影响及其调控机制，旨在阐明异氟醚促进AD发病的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、药品与主要试剂 大鼠PC12细胞购于中国科学院上海细胞生物研究所；DMEM高糖培养液、胎牛血清、谷氨酰胺、青霉素、链霉素、多聚赖氨酸和0.25%胰蛋白酶及磷酸缓冲液（PBS）均购自Gibco公司，Aβ25-35、二甲基亚砜（DMSO）和四甲基偶氮唑盐（MTT）购于Sigma公司，异氟醚购于雅培公司，BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司，小鼠单克隆抗β肌动蛋白（β-actin）抗体、兔抗大鼠多克隆抗微管相关蛋白1轻链3－Ⅱ（LC3-Ⅱ）、细胞自噬受体蛋白p62、B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，bcl-2）、半 胱 氨 酸 蛋 白 酶-3（caspase-3）、Beclin-1 和p-mTOR抗体购自Abcam公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠、羊抗兔二抗购自美国Cell Signaling Technology公司，化学发光检测（ECL）试剂盒购自Santa Cruz公司，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜购自Millipore公司。

1.2 聚集态 Aβ25-35制备 Aβ25-35溶于无菌去离子双蒸水中，配制成浓度为1mmol·L－1Aβ25-35原液，保存于－80℃冰箱中。使用前置于37℃恒温箱内孵育7d获得聚集态Aβ25-35，以无菌培养基稀释，其作用终浓度为10μmol·L－1，于4℃冰箱储存。

1.3 细胞培养 PC12细胞培养在高糖DMEM培养液（含10%热灭活胎牛血清，1%谷氨酰胺，100U·mL－1青霉素，100mg·L－1链霉素）中，置于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养，每2～3d换液，待单层细胞70%～80%汇合后，用0.25%胰酶消化后传代培养。

1.4 细胞分组和药物处理 取对数生长期的PC12细胞，按照1.0×104mL－1、5.0×104mL－1和1.0×106mL－1密度接种于多聚赖氨酸包被过的96孔培养板、24孔培养板或6cm培养皿中，每组6孔或6皿。PC12细胞加入含10%胎牛血清DMEM培养液，在37℃、5%CO2条件下培养24h后，弃去原培养液，加入含1%胎牛血清DMEM培养液2h，采用随机数字表法，将其随机分 为 4组（n＝6）： 正 常 对 照 组 （C 组）、10μmol·L－1Aβ25-35处理组（Aβ组）、2%异氟醚处理组（Iso组）、2%异氟醚与10μmol·L－1Aβ25-35联合处理组（Iso＋Aβ 组）。C 组加入DMEM培养液；Aβ组加入 Aβ25-35，终浓度为10μmol·L－1；Iso组将培养板或培养皿置入特制的无菌密闭容器中，容器有2个气体进出孔，进气孔连接麻醉机，通入95%空气-5%CO2混合气体，流量2L·min－1，并通过专用麻醉挥发罐给予异氟醚，容器的出气口连接麻醉气体监测仪（Ohmeda公司，美国），检测并维持异氟醚浓度为2%，持续6h；Iso＋Aβ组给予2%异氟醚6h的同时加入10μmol·L－1Aβ25-35。各组PC12细胞分别给予异氟醚6h和（或）Aβ25-35 6及24h，进行相关实验检测。

1.5 透射电镜观察自噬体的形成 培养的PC12细胞经异氟醚和（或）Aβ25-35处理6h，用胰酶消化并收集细胞，于4℃离心5min，弃上清，将标本经2.5%戊二醛固定过夜，加入1%四氧化锇再次固定2h。乙醇逐级脱水，环氧树脂包埋。应用切片机切成超薄切片，1%水化醋酸铀和枸橼酸铅染色。JEM-2100F透射电镜观察PC12细胞内自噬体的形成及分布。

1.6 Western blotting法检测自噬相关蛋白和凋亡相关蛋白表达 细胞按实验分组给予不同的处理后，常规离心收集细胞，加入裂解缓冲液，4℃静置30min。12 000g离心10min，取上清，提取细胞总蛋白。采用BCA试剂盒进行蛋白定量。取各组蛋白质30μg，经10%十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离后，电转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭1.5h，分别加入1∶500比例稀释的小鼠抗β-actin抗体、兔抗大鼠 LC3-Ⅱ、 p62、 p-mTOR、 Beclin-1、 Bcl-2、caspase-3抗体，4℃孵育过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的抗小鼠、抗兔（1∶1 000）二抗，室温孵育l h后洗膜，将PVDF膜用发光试剂ECL显色后，用X光胶片压片成像。条带蛋白吸光度（A）值用Bandscan 5.0凝胶图像分析软件分析，每样本重复3次。以每个样本条带A值/β-actin A值的比值表示蛋白的相对表达量。

1.7 MTT法检测细胞活性 PC12细胞接种于96孔板中，各组进行相应药物处理24h后，每孔加入15μL MTT溶液（质量浓度为5g·L－1），37℃孵育4h后吸弃孔内上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，振荡10min，Model 550型酶标仪（BIO-RAD公司，美国）于570nm波长处检测各孔A值，细胞相对存活率（%）＝（各实验孔A值/对照组平均A值）×100%。

1.8 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计分析。各组细胞存活率以及LC3－Ⅱ、p62、p-mTOR、Beclin-1、Bcl-2和caspase-3蛋白表达量以±s表示，组间比较采用重复测量设计的方差分析。

2 结 果

2.1 透射电镜观察结果 C组和Iso组PC12细胞胞浆中未见自噬体；Aβ组PC12细胞经Aβ25-35处理6h，胞浆中可见大量的双层膜结构的自噬体（黑色箭头所示）；Iso＋Aβ组PC12细胞同时给予异氟醚和Aβ25-35处理6h，胞浆内仅有少量自噬体的形成。见图1。

图1 透射电镜观察各组PC12细胞自噬体（×20 000）Fig.1 Autophagosomes of PC12cells in various groups observed by transmission electron microscope（×20 000）

2.2 各组PC12细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62的表达量 与C组比较，Aβ组PC12细胞LC3－Ⅱ表达量升高（P＜0.05），p62表达量降低（P＜0.05），而Iso组PC12细胞LC3－Ⅱ表达量降低（P＜0.05），p62 表 达 量 升 高（P＜0.05）；与Aβ组比较，Iso＋Aβ组PC12细胞LC3－Ⅱ表达量降低（P＜0.05），p62表达量升高（P＜0.05）。见图2和表1。

图2 Western blotting法检测各组PC12细胞LC3-Ⅱ、p62、p-mTOR和Beclin-1蛋白的表达Fig.2 Expressions of LC3-Ⅱ，p62，p-mTOR，and Beclin-1protein in PC12cells in various groups detected by Western blotting method

表1 各组PC12细胞 LC3-Ⅱ、p62、pmTOR、Beclin-1、Bcl-2和caspase-3的表达Tab.1 Expressions of LC3-Ⅱ，p62，p-mTOR，Beclin-1，Bcl-2and caspase-3in PC12cells in various groups（n＝6，±s）

表1 各组PC12细胞 LC3-Ⅱ、p62、pmTOR、Beclin-1、Bcl-2和caspase-3的表达Tab.1 Expressions of LC3-Ⅱ，p62，p-mTOR，Beclin-1，Bcl-2and caspase-3in PC12cells in various groups（n＝6，±s）

＊ P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with Aβgroup.

2±11.6 112.2±16.2 55.1±7.3 Aβ 120.2±13.4＊ 59.9±9.4＊ 64.8±8.2＊ 100.4±14.6＊ 12.1±3.7＊ 124.6±13.3＊Iso 30.4±5.3＊ 169.6±21.7＊ 179.6±25.1＊ 45.1±5.1＊ 98.3±7.8＊ 109.5±8.8＊Iso＋ Aβ 79.8±8.1△ 110.2±12.4△ 110.3±20.2△ 80.4±9.2△ 9.6±4.5 175.7±20.1-actin Control 69.8±10.2 120.3±15.8 130.3±16.2 50.Group LC3-Ⅱ/β-actin p62/β-actin p-mTOR/β-actin Beclin-1/β-actin Bcl-2/β-actin caspase-3/β△

2.3 各组PC12细胞自噬信号调控基因p-mTOR和Beclin-1的表达量 与C组比较，Aβ组PC12细胞p-mTOR 表达量减少（P＜0.05），Beclin-1表达量升高（P＜0.05），而Iso组PC12细胞p-mTOR表达量升高（P＜0.05），Beclin-1表达量减少（P＜0.05）；与 Aβ组比较，Iso＋Aβ组PC12 细 胞 p-mTOR 表 达 量 升 高（P＜0.05），Beclin-1表达量减少（P＜0.05）。见图2和表1。

2.4 各组PC12细胞活性 C组PC12细胞存活率为98.2%±2.8%；与C组比较，Aβ组和Iso组PC12细胞存活明显降低，其存活率分别为83.7%±12.6%和87.6%±9.7%（P＜0.05）；Iso＋ Aβ组PC12细胞存活率为70.3%±7.2%，与Aβ组比较，其存活率进一步降低（P＜0.05）。

2.5 各组 PC12细胞凋亡相关蛋白 Bcl-2和caspase-3的表达量 与C组比较，Aβ组和Iso组PC12细胞Bcl-2表达量减少（P＜0.05），caspase-3表达量升高（P＜0.05）；与Aβ组比较，Iso＋Aβ组PC12细胞caspase-3表达量升高（P＜0.05），Bcl-2表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3和表1。

图3 Western blotting法检测各组PC12细胞Bcl-2和caspase-3的表达Fig.3 Expressions of Bcl-2and caspase-3in PC12cells in various groups detected by Western blotting method

3 讨 论

自噬是细胞内由溶酶体介导的蛋白质和细胞器降解过程，能够使细胞通过消化自身组分获得能量和营养、对抗环境和应激的变化，其特征是胞浆内形成自噬体和自噬溶酶体。LC3-Ⅱ是哺乳动物细胞中酵母ATG8基因的同源物，定位于前自噬体和自噬体膜上，是检测自噬活性的标志蛋白。p62蛋白是一种接头蛋白，能够连接泛素化蛋白与自噬受体结合，作为自噬的一个选择性降解底物，其表达水平与自噬活性呈负相关关系。本研究结果显示：与C组比较，Aβ组PC12细胞经Aβ25-35处理6h胞浆中可见大量的自噬体，LC3-Ⅱ表达量升高、p62表达量减少，表明Aβ25-35能够明显诱导PC12细胞自噬的活化。本研究结果显示：Iso组PC12细胞未见自噬体，与C组比较，其LC3－Ⅱ表达量减少、p62表达量升高，而Iso＋Aβ组PC12细胞同时给予异氟醚和Aβ25-35处理6h胞浆内仅有少量自噬体的形成，与Aβ组比较，其LC3－Ⅱ表达量减少、p62表达量升高，提示异氟醚不仅能够抑制正常的自噬功能，还能明显抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞自噬的活化。

自噬作为细胞保持稳定状态的管家机制，可调控长寿命蛋白、过氧化物体、线粒体和内质网的更新。在应激情况下，自噬作为一种防御机制清除胞质内受损的线粒体、凋亡因子、代谢产物，保护细胞免于凋亡和死亡的危险。细胞凋亡的发生受一些凋亡相关基因的调控，如 Bcl-2、caspase-3等。Bcl-2是目前发现的最重要的抗凋亡基因，具有抑制细胞凋亡的作用。caspase-3是细胞凋亡途径的最后效应子，能够导致细胞凋亡。本研究结果显示：与C组比较，Aβ组PC12细胞经Aβ25-35处理24h后，细胞存活率降低，Bcl-2表达量减少、caspase-3表达量升高，表明 Aβ25-35不仅能活化PC12细胞自噬，也能诱导PC12细胞凋亡，但自噬的活化（6h）优先于细胞凋亡（24h）。研究[1－3]发现：自噬功能的改变与AD密切相关。也有研究[1]表明：在AD早期就存在自噬功能的改变，而自噬抑制能够引起AD的病程加剧。另一方面研究[9－10]显示：增强自噬能够保护神经元，避免Aβ诱导的神经毒性。Hung等[9]研究指出：增强自噬能抑制Aβ诱导的细胞死亡，增加海马神经元的存活。Cheung等[10]证明：自噬能够保护神经元避免Aβ诱导的细胞凋亡。本研究结果显示：与C组比较，Iso组细胞存活率降低，Bcl-2表达量减少、caspase-3 表 达 量 升 高；与 Aβ 组 比 较，Iso＋Aβ组PC12细胞存活率进一步降低，caspase-3表达量升高，提示异氟醚能够通过抑制自噬的活化，促进caspase-3表达增加，进而加重Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡。在过度表达人类APP基因的AD细胞模型上研究[11]发现：临床相关浓度的异氟醚能降低细胞的生存、增加Aβ的生成、促进caspase-3活化、诱导细胞凋亡。在正常神经细胞和自然小鼠脑内研究[8，12－14]发现：异氟醚能促进细胞色素C的释放，诱导caspase-3活化和凋亡，增加Aβ的生成，而给予Aβ能进一步增加异氟醚诱导的神经毒性，促进caspase-3活化和凋亡，上述观点均支持本研究结果。

自噬过程的信号调控与mTOR和Beclin-l基因有关。mTOR激酶是氨基酸、ATP和激素的感受器，对细胞生长具有重要调节作用，抑制自噬的发生，是自噬的负性调控分子。Beclin-l基因为酵母ATG6的同系物，是介导自噬蛋白定位于前自噬小体的关键因子，参与哺乳动物自噬体形成的调控。Spilman等[15]研究发现：抑制 mTOR，能够增强自噬活性，减少脑内Aβ的水平，消除AD模型小鼠的认知功能缺陷，增加小鼠的寿命。Pickford等[3]研究证实：AD发病早期患者受损的脑区中存在自噬活化关键蛋白Beclin-1的减少，而Beclin-1减少能够增加神经细胞内Aβ的堆积、细胞外 Aβ的沉积和神经细胞的变性。研究[16－18]发现：Beclin-1具有保护作用，能够调节AD的病理过程；Beclin-1的缺乏能增加Aβ的产生，引起AD小鼠模型的病理进程加快。本研究结果显示：与C组比较，Aβ组p-mTOR表达量减少、Beclin-1表达量升高，表明Aβ25-35能够通过抑制mTOR激活促进Beclin-1的表达，进而诱导PC12细胞自噬的活化。本研究结果还显示：与C组比较，Iso组p-mTOR表达量升高、Beclin-1表达量减少；与Aβ组比较，Iso＋Aβ组p-mTOR表达量升高、Beclin-1表达量减少，提示异氟醚抑制自噬的分子机制与激活mTOR、抑制Beclin-1的表达有关。

综上所述，异氟醚能够抑制Aβ25-35诱导大鼠PC12细胞自噬的活化，促进凋亡蛋白的表达，其作用机制与激活自噬信号调控基因mTOR、抑制Beclin-1的表达有关。

[1]Li L， Zhang X， Le W. Autophagy dysfunction in Alzheimer’s disease[J].Neurodegener Dis，2010，7（4）：265-271.

[2]Salminen A，Kaarniranta K，Kauppinen A，et al.Impaired autophagy and APP processing in Alzheimer’s disease：The potential role of Beclin 1interactome[J].Prog Neurobiol，2013，106-107（2）：33-54.

[3]Pickford F，Masliah E，Britschgi M，et al.The autophagyrelated protein beclin 1shows reduced expression in early Alzheimer disease and regulates amyloid beta accumulation in mice[J].J Clin Invest，2008，118（6）：2190-2199.

[4]Bufill E， Bartés A， Moral A， et al. Genetic and environmental factors that may influence in the senile form of Alzheimer’s disease：nested case control studies [J].Neurologia，2009，24（2）：108-112.

[5]Zhang B，Tian M，Zheng H，et al.Effects of anesthetic isoflurane and desflurane on human cerebrospinal fluid Aβand tau level[J].Anesthesiology，2013，119（1）：52-60.

[6]van der Weyde T， Bednar MM， Forman SA， et al.Iatrogenic risk factors for Alzheimer’s disease：surgery and anesthesia[J].J Alzheimers Dis，2010，22（Suppl 3）：91-104.

[7]Perucho J，Casarejos MJ，Gomez A，et al.Trehalose protects from aggravation of amyloid pathology induced by isoflurane anesthesia in APP（swe）mutant mice[J].Curr Alzheimer Res，2012，9（3）：334-343.

[8]Zhang Y，Dong Y，Wu X，et al.The mitochondrial pathway of anesthetic isoflurane-induced apoptosis[J].J Biol Chem，2010，285（6）：4025-4037.

[9]Hung SY，Huang WP，Liou HC，et al.Autophagy protects neuron from Abeta-induced cytotoxicity [J].Autophagy，2009，5（4）：502-510.

[10]Cheung YT，Zhang NQ， Hung CH，et al.Temporal relationship of autophagy and apoptosis in neurons challenged by low molecular weight beta-amyloid peptide[J].J Cell Mol Med，2011，15（2）：244-257.

[11]Xie Z，Dong Y，Maeda U，et al.The common inhalation anesthetic isoflurane induces apoptosis and increases amyloid beta protein levels [J].Anesthesiology，2006，104（5）：988-994.

[12]Yan H，Xu T，Zhao H，et al.Isoflurane increases neuronal cell death vulnerability by downregulating miR-214[J].PLoS One，2013，8（2）：e55276.

[13]Xie Z，Culley DJ，Dong Y，et al.The common inhalation anesthetic isoflurane induces caspase activation and increases Aβlevel in vivo[J].Ann Neurol，2008，64（6）：618-627.

[14]Xu J，Zhang R，Zuo P，et al. Aggravation effect of isoflurane on Aβ（25-35）-induced apoptosis and tau hyperphosphorylation in PC12cells[J].Cell Mol Neurobiol，2012，32（8）：1343-1351.

[15]Spilman P，Podlutskaya N，Hart MJ，et al.Inhibition of mTOR by rapamycin abolishes cognitive deficits and reduces amyloid-beta levels in a mouse model of Alzheimer’s disease[J].PLoS One，2010，5（4）：e9979.

[16]Xue Z，Zhang S，Huang L，et al.Upexpression of Beclin-1-dependent autophagy protects against beta-amyloid-induced cell injury in PC12cells[J].J Mol Neurosci，2013，51（1）：180-186.

[17]Jaeger PA，Pickford F，Sun CH，et al.Regulation of amyloid precursor protein processing by the Beclin 1 complex[J].PLoS One，2010，5（6）：e11102.

[18]陶文雁，黄可欣，石 博，等.异氟醚对成年大鼠脑组织活性影响的实验研究 [J].中国实验诊断学，2013，17（3）：455-456.