系统性红斑狼疮患者糖皮质激素联合免疫抑制剂治疗前后外周血NK细胞和受体表达变化及其治疗作用机制

冯 莉，赵 令，马 宁，姜振宇

（吉林大学第一医院风湿科，吉林 长春 130021）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种累积多系统、多器官并由多种因素相互作用引起的自身免疫性结缔组织病，临床表现复杂，病程迁延反复，其病因及发病机制至今不明。大量研究[1]表明：多种因素通过影响细胞免疫功能紊乱而致病，SLE存在T、B细胞功能紊乱，但SLE患者外周血淋巴细胞亚群改变与疾病的活动性之间的关系尚有争论，多数学者认为T淋巴细胞功能的紊乱引起B淋巴细胞的高度活化而产生多种自身抗体是本病发生和发展主要因素。自然杀伤（natural killer，NK）细胞具有多种功能，不仅是自然防御细胞，而且是体内多种细胞，尤其是T、B细胞的免疫调节细胞，在机体正常的免疫、防御机制中起重要作用。目前，SLE

的治疗主要是糖皮质激素联合免疫抑制剂，控制疾病过程中异常的炎症和免疫反应，对于治疗前后

NK细胞及其受体表达的变化研究较少。本研究采用流式细胞术检测SLE患者经糖皮质激素联合免疫抑制剂干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）治疗前后外周血细胞NK细胞及其受体的表达变化，旨在探讨其治疗SLE的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年1月—2013年1月本院收治的26例SLE患者，均符合1997年美国风湿病学会（ARA）修订的SLE诊断标准[2]，其中男性1例，女性25例，年龄18～56岁，平均年龄（27±6）岁。SLE患者给予氢化泼尼松联合免疫抑制剂治疗，分别于第4和12周采集患者静脉全血。在门诊选取16例健康人作为健康对照组，男性2例，女性14例，年龄20～50岁，平均年龄（25±5）岁。SLE组与健康对照组年龄、性别比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 外周血NK细胞及其受体的检测 采取对照组和治疗前、治疗后4及12周SLE患者的外周血，采用各种单抗染色剂流式细胞术测定外周血中CD3－CD56＋NK细胞比率及其不同受体的表达率。每个采集管采集50μL血液，加入5μL单克隆抗体，包括FITC偶联CD3单克隆抗体、APC偶联CD56单克隆抗体、PerCP偶联CD16单克隆抗体、PE偶联NKG2D单克隆抗体、NKG2C单克隆抗体、NKp30单克隆抗体、NKp44单克隆抗体、NKp46单克隆抗体、NKG2A单克隆抗体、KIR2DL3单克隆抗体、KIR3DL1单克隆抗体、CD158a单克隆抗体、CD158b单克隆抗体（美国BD公司）。样本在室温下放置20～30min，之后加入FACS细胞裂解液（美国BD公司），静置6min。用PBS缓冲液洗过2遍后，应用流式细胞仪的数据分析软件（v5.7.2）检测 CD3－CD56＋NK细胞比率及其受体 NKG2C＋、NKG2D＋、NKP30＋、 NKP46＋、 KIR2DL3＋、 KIR3DL1＋、NKG2A＋、CD158a＋和CD158b＋的表达率。

1.3 外周血中IFN-γ＋CD3－CD56＋NK细胞比率检测 无菌管采集受检者治疗前及治疗后4和12周外周血8mL，肝素抗凝，采用密度梯度离心法无菌分离制备单个核细胞（PBMCs），用RPMI 1640细胞培养液（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）调整细胞数至1×109L－1，加入浓度为50μg·L－1的PMA和1.0mg·L－1的离子霉素，将培养板放入37℃、5%的CO2培养箱中温育2h，加入PBS的PBMCs作为对照组，加入1.0mg·L－1Brefeldin A（GolgiPlug，Becton Dickinson）的细胞额外孵育4h。用PBS缓冲液洗2次，洗涤后细胞内染色：分别加入抗-CD56和抗-CD3mAbs（美国BD公司）及同型对照单抗，室温温育30min，同样用PBS洗涤后加入4%的多聚甲醛100μL，室温温育30min，加入300μL的0.5%破膜剂和10%FBS固定液，经过几次PBS洗涤，加入PE偶联抗-IFN-γ后放4℃冰箱备用。应用流式细胞仪检测外周血中IFN－γ＋CD3－CD56＋NK细胞比率。

1.4 统计学分析 采用SPSS 14.0统计学软件进行统计学分析。受检者外周血中CD3－CD56＋NK细胞比率及其不同受体表达率以±s表示，组间比较采用t检验。

2 结 果

2.1 SLE患者外周血CD3－CD56＋NK细胞比率及其受体表达 与健康对照组比较，治疗前SLE患者外周血中CD3－CD56＋NK细胞比率明显降低（P＜0.05），其激活性受体NKG2C＋、NKP30＋和NKP46＋的表达率明显增高（P＜0.05），抑制性受体KIR2DL3＋、KIR3DL1＋和NKG2A＋表达率均明显降低（P＜0.05），而NKG2D＋、CD158a＋和CD158b＋的表达率差异均无统计学意义（P＞0.05）。与治疗前比较，治疗4和12周后SLE患者外周血中CD3－CD56＋NK细胞比率较治疗前均明显增高（P＜0.05）。治疗4周后，NKG2C＋、NKP30＋及NKP46＋表达率较治疗前明显降低（P＜0.05），治疗12周后上述受体的表达率较治疗前进一步降低（P＜0.05）。治疗4周后，KIR2DL3＋、KIR3DL1＋及 NKG2A＋表达率较治疗前明显增高（P＜0.05），治疗 12 周后KIR3DL1＋、CD158a＋、CD158b＋及 NKG2A＋的表达率较治疗前均明显增高（P＜0.05）。见表1。

2.2 SLE患者外周血中IFN-γ＋CD3－CD56＋NK细胞的比率 治疗前SLE患者外周血中IFNγ＋CD3－CD56＋NK细胞比率（28.050%±4.067%）与健康对照组（4.649%±1.995%）比较明显增高（P＜0.001）；治疗4和12周后，SLE患者外周血中IFN－γ＋CD3－CD56＋NK细胞比率（7.545%±0.7265%和5.296%±1.399%）较治疗前均明显降低（P＜0.001）。

表1 各组受检者外周血CD3－CD56＋NK细胞比率及其不同受体表达率Tab.1 Ratios of CD3－CD56＋ NK cells in peripheral blood and expression rates of their different receptors of subjects in various groups （±s，η/%）

表1 各组受检者外周血CD3－CD56＋NK细胞比率及其不同受体表达率Tab.1 Ratios of CD3－CD56＋ NK cells in peripheral blood and expression rates of their different receptors of subjects in various groups （±s，η/%）

＊ P＜0.05compared with healthy control group；△P＜0.05compared with before treatment.

Group nRatio of CD3－CD56＋NK cells NKG2C＋ NKG2D＋ NKP30＋ NKP46＋0.562 16.600±2.530 13.950±1.360 SLE 26 Before treatment 1.690±0.203＊ 29.520±4.507＊ 93.580±2.406 45.070±3.616＊ 41.360±4.678＊4weeks after treatment 2.961±0.236△ 8.861±0.919△ 91.560±1.047 17.710±2.312△ 24.840±3.548△12weeks after treatment 8.920±0.939△ 9.896±1.651△ 88.370±2.153 23.330±4.546△ 19.140±2.195△Group n NKG2A＋ KIR2DL3＋ KIR3DL1＋ CD158a＋ CD158b＋Healthy control 16 27.220±3.169 30.340±15.708 15.77 Healthy control 16 9.306±1.283 13.130±3.584 86.570±0±1.303 22.010 ±2.798 19.540±3.849 SLE 26 Before treatment 5.659±1.311＊ 5.197±0.9154＊ 3.237±1.261＊ 11.220±2.597 10.820±1.592 4weeks after treatment 28.610±4.075△ 10.980±0.878△ 7.229±0.941△ 15.650±2.367 16.370±2.811 12weeks after treatment 38.690±3.406△ 28.760±3.266△ 17.160±2.641△ 24.270±1.925△ 18.900±2.496△

3 讨 论

SLE是一种常见且严重的自身免疫性疾病，免疫功能失调是其发病机制的关键环节。由于大多数的SLE患者病情复杂，且变化较快，所以SLE的治疗首选糖皮质激素联合免疫抑制剂。糖皮质激素可以明显地抑制免疫细胞的许多功能和免疫反应的各个环节，尤其对细胞免疫有突出的抑制作用；大剂量激素的应用还对体液免疫有抑制作用，减少抗体产生；超大剂量激素的应用有直接的淋巴细胞溶解作用。

CD3－CD56＋NK细胞是天然免疫系统的重要组成部分，在抗病毒感染免疫、肿瘤免疫、移植排斥反应及免疫调节中起十分重要的作用[3]。本研究结果显示：CD3－CD56＋NK细胞数量在SLE患者体内明显下降，与此前的研究[4－5]结果相似，其机制可能是SLE患者体内存在较高水平的循环免疫复合物，这些循环免疫复合物可能是导致CD3－CD56＋NK细胞数和细胞毒作用低下的重要原因[6]。同时，CD3－CD56＋NK细胞数量的减少导致对自身抗体产生的抑制作用减弱，多种自身抗体的产生导致SLE多脏器受损。本研究结果显示：治疗4和12周后CD3－CD56＋NK细胞的数量有所升高，提示SLE患者由于NK细胞的表达减少，使之对T、B细胞的调节作用减弱，并可能进一步使T、B和NK细胞这3种重要的免疫细胞失去平衡，使SLE患者表现为整个免疫系统的紊乱；而应用糖皮质激素和免疫抑制剂治疗后，NK细胞的活性增高，主要通过释放细胞因子对机体免疫功能加以调节，可抑制B细胞的分化和增殖，同时对T细胞介导的免疫起调节作用。NK细胞表面存在识别靶细胞表面分子的活化受体和抑制受体，其对靶细胞是否发挥杀伤作用取决于活化与抑制性信号的综合。活化性受体包括自然细胞毒受体NKp30、NKp46、NKp44、NKG2C、NKG2D 和一些活化相关的受体；抑制性受体主要包括C型凝集素家族的CD94-NKG2A及杀伤免疫球蛋白样受体（KIR）如 KIR2DL3、KIR3DL1、KIR2DL1（即 CD158a） 和 KIR2DL2/KIR2DL3（即CD158b）等。正常情况下，CD3－CD56＋NK细胞的抑制性受体与正常细胞表达的HLAⅠ类分子结合后转导负性信号，即NK细胞失活，对自身抗体产生耐受，阻止CD3－CD56＋NK细胞对宿主自身正常细胞的杀伤作用。本研究结果显示：与健康对照组比较，SLE患者外周血CD3－CD56＋NK细胞比率明显降低；SLE患者激活性受体NKG2C＋、NKP30＋和NKP46＋的表达率明显增高，抑制性受体KIR2DL3＋，KIR3DL1＋和NKG2A＋的表达率明显降低；治疗4和12周后NKG2C＋、NKP30＋和NKP46＋表达率较治疗前明显降低；而治疗4周后KIR2DL3＋、KIR3DL1＋和NKG2A＋表达率较治疗前明显增高；治疗12周后 KIR3DL1＋、CD158a＋、CD158b＋和NKG2A＋表达率较治疗前亦明显增高。上述结果与Herner等[7]的研究结果一致，表明SLE患者治疗后较治疗前激活性受体明显降低，抑制性受体明显增高，其机制可能是SLE患者外周血中CD3－CD56＋NK细胞识别自身HLAⅠ类分子水平下降时，抑制性受体与HLAⅠ类分子作用水平减低或不能与之结合，导致抑制CD3－CD56＋NK细胞活化的信号减弱或缺乏，启动活化性受体转导的活化信号，使CD3－CD56＋NK细胞活化，发挥细胞毒作用，裂解靶细胞。而应用糖皮质激素和免疫抑制剂治疗后，可能CD3－CD56＋NK细胞的抑制性受体明显增高，阻止其对宿主自身正常细胞的杀伤作用[8]，具体机制尚有待研究。IFN-γ是NK细胞活化后所分泌的重要效应因子，主要在免疫应答的效应阶段发挥作用，同时也是一种典型的Th1型细胞因子，通过调节MHC－Ⅰ和MHC－Ⅱ类分子在大多数免疫细胞内的表达，提高细胞免疫，增强B细胞活化，消弱NK细胞的细胞毒活性。本研究结果显示：SLE患者IFN－γ＋CD3－CD56＋NK细胞比率与健康对照组比较明显增高，这与先前的研究[9－11]结果一致；而在治疗4和12周后较治疗前均明显降低，因此IFN-γ可能与 SLE患者的发病有关。有研究[7，12]表明：IFN-γ基因敲除的MRL-Faslpr小鼠其组织损伤和血清学特征均明显减轻，生存时间明显延长，证明IFN－γ在SLE发病中的作用至关重要。糖皮质激素可以抑制IFN－γ的产生，故治疗后IFN-γ较治疗前减少，可能是应用糖皮质激素及免疫抑制剂后，导致CD3－CD56＋NK细胞的细胞毒作用增强，抑制B细胞活化和多种自身抗体的产生。

综上所述，利用FCM检测SLE患者治疗后CD3－CD56＋NK细胞及其受体表达的研究，对全面了解SLE患者治疗前及治疗后机体的免疫状态变化情况有重要意义。在SLE的治疗中，如进一步了解上述细胞在SLE发病和治疗中的作用，有利于SLE的治疗，以期找到SLE治疗的新靶点。

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