TGM2基因多态性与中国北方汉族人群精神分裂症的关联性分析

杜伟利，王嘉欣，惠 李，赵鑫丽，赵晓霞，王珍琦，刘 扬，张 萱

（1.吉林大学公共卫生学院基因组医学研究中心，吉林 长春 130021；2.北京市通州区卫生局卫生监督所，北京 101100；3.吉林大学第二医院肾病内科，吉林 长春 130041）

组织转谷氨酰胺酶2（transglutaminase 2，TGM2）又称谷氨酰胺转胺酶，是小肠上皮细胞产生的酶，可催化蛋白质或多肽中特异的谷氨酰胺残基的脱酰胺作用和转酰胺基作用，在肠上皮下细胞高表达。TGM2对谷蛋白有强亲和力，是谷蛋白抗体产生的关键分子，可催化谷氨酰胺自身或与其他细胞外蛋白交联形成聚合物，该聚合物可被抗原提呈细胞识别和吸收[1]。TGM2的脱酰胺作用可增强谷蛋白T细胞抗原表位对MHC classⅡ分子（HLA-DQ2或 HLA-DQ8）的亲和力，提呈疾病相关抗原表位给CD4＋T细胞，刺激抗体产生。

TGM2和一些人类疾病紧密相关，如乳糜泻、神经退行性病变、癌症、炎症和组织纤维化等。乳糜泻，也被称为谷蛋白敏感性肠道疾病，是一种小肠多因素疾病[2]。TGM2基因已被确定为乳糜泻的易感基因之一。近年研究[3]发现：儿童时期具有乳糜泻病史的人群成年后其精神分裂症的患病风险高达3倍，精神分裂症患者血浆谷蛋白抗体水平显著增高，无谷蛋白膳食可改善精神分裂症患者的精神症状。这些发现提示：谷蛋白可能是精神分裂症发病的一种环境触发因子。2009年，Bradford等[4]在对131个英国精神分裂症核心家系进行TGM2基因与精神分裂症发病的连锁不平衡研究中发现：rs2076380、rs7270785、rs4811528和s6023526 4个单核苷核多态性（SNPs）位点与精神分裂症发病密切相关，TGM2基因可能赋予精神分裂症发病易感性。本研究采用大样本病例－对照关联研究方法，进一步在中国北方汉族人群中探讨TGM2基因与精神分裂症发病及临床表型的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本组所有样本均为中国北方汉族人。精神分裂症患者428例，来自吉林省长春市心理医院2005—2008年住院患者，经2位经验丰富的临床医师按照国际疾病分类标准第10版（ICD-10）精神分裂症诊断标准确诊为精神分裂症，平均年龄（39.15±12.56）岁。健康对照组555例，来源于医院工作人员及健康献血者，平均年龄（38.61±13.27）岁，身体健康，无严重的躯体疾病，无精神疾病及精神疾病家族史。

1.2 样本的收集及基因组DNA的提取 精神分裂症患者与健康对照个体经知情同意后，采集外周静脉血5mL，－20℃分装保存。采用Promage DNA纯化试剂盒提取基因组DNA，具体方法参见文献[5]。

1.3 引物设计与合成 利用国际互联网（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNPs）在人类基因组数据库中检索TGM2基因的基因组序列，利用Primer 5软件在各SNPs位点上、下游设计引物。各SNPs位点见表1，引物序列见表2。PCR扩增体系及条件参照文献 [5]。

表1 TGM2基因各SNPs位点Tab.1 SNPs at each site of TGM2gene

表2 TGM2基因各SNPs位点的PCR引物序列及限制性内切酶Tab.2 PCR primers and restriction endonucleases used for SNPs genotypes at TGM2locus

1.4 限制性内切酶消化PCR产物 反应体系及条件参照文献 [5]。反应体系20μL，包括PCR扩增产物15μL，10× Buffer 2μL，BSA 0.2μL，限制性内切酶0.8μL（表1），用灭菌水补足体积。37℃消化过夜后，用2.5%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，根据酶切图谱判断个体基因型。

1.5 统计学分析 采用SPSS 15.0统计软件进行统计学分析。应用拟合优度χ2检验分析基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，应用χ2检验进行等位基因、基因型关联分析及临床表型分析。

2 结 果

2.1 PCR扩增和限制性片段长度多态性（RFLP）分析 rs2076380位点PCR扩增片段长度为280bp，经限制性内切酶BstNⅠ消化后，形成95和185bp 2个片段，3种基因型：A/A纯合切开型、A/G杂合型和G/G纯合未切开型（图1）；rs7270785位点PCR扩增片段长度为485bp，经限制性内切酶FokⅠ消化后，形成209和276bp 2个片段，3种基因型：G/G纯合切开型、G/T杂合型和T/T纯合未切开型（图2）；rs4811528位点PCR扩增片段长度为246bp，经限制性内切酶MspⅠ消化后，形成99和147bp 2个片段，3种基因型：G/G纯合切开型、G/A杂合型和A/A纯合未切开型（图3）；rs6023526位点：PCR扩增片段长度为374bp，经限制性内切酶MspⅠ消化后，形成165和209bp 2个片段，3种基因型：C/C纯合切开型、C/T杂合型和 T/T纯合未切开型（图4）。

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验 拟合优度χ2检验结果显示：4个SNPs位点的基因型频数分布在病例组和对照组中均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（P＞0.05），说明本研究所应用的样本来自于随机婚配群体。见表3和4。

图1 rs2076380位点限制性酶切电泳图Fig.1 Electrophoregram of rs2076380after BstN Ⅰdigestion

图2 rs7270785位点限制性酶切电泳图Fig.2 Electrophoregram of rs7270785after FokⅠdigestion

图3 rs4811528位点限制性酶切电泳图Fig.3 Electrophoregram of rs4811528after MspⅠdigestion

2.3 等位基因和基因型关联性分析 rs2076380、rs7270785、rs4811528和rs6023526 4个SNPs位点的等位基因在病例组和对照组中的频数分布比较差异均无统计学意义（χ2＝0.831，P＝0.362；χ2＝0.591，P＝0.442；χ2＝0.296，P＝0.586；χ2＝0.092，P＝0.762）；3种基因型在病例组和对照组的频数分布比较差异也无统计学意义（χ2＝1.951，P＝0.377；χ2＝1.399，P＝0.497；χ2＝0.313，P＝0.855；χ2＝0.701，P＝0.704）。提示rs2076380、rs7270785、rs4811528和rs6023526位点与精神分裂症发病无关联。见表5和6。

图4 rs6023526位点限制性酶切电泳图Fig.4 Electrophoregram of rs6023526after MspⅠdigestion

表3 病例组TGM2基因各SNPs位点Hardy-Weinberg遗传平衡检验Tab.3 Goodness-of-fitχ2 test for Hardy-Weinberg equilibrium of SNPs sites of TGM2gene in case group

表4 健康对照组TGM2基因各SNPs位点Hardy-Weinberg遗传平衡检验Tab.4 Goodness-of-fitχ2 test for Hardy-Weinberg equilibrium of SNPs sites of TGM2gene in control group

表5 病例组及对照组TGM2基因各SNPs位点等位基因频数分布Tab.5 Distribution of allelic frequencies of SNPs sites of TGM2gene in case group and control group [n（η/%）]

2.4 TGM2基因与精神分裂症行为学临床表型的关 系 rs2076380、rs7270785、rs4811528 和rs6023526 4个SNPs位点基因型与真性听幻觉、关系妄想、影响妄想、自罪妄想、虚无妄想、被洞悉感、被迫害妄想、嫉妒妄想、夸大妄想、钟情妄想、其他妄想、思维连贯性障碍、思维逻辑性障碍、古怪行为、攻击性行为、幻觉－妄想综合征等阳性表型及与思维贫乏、情感迟钝/淡漠、意志缺乏等阴性表型均无关联（P＞0.05）。进一步证明TGM2基因与中国汉族人群精神分裂症发病无关联。见表7和8。

表6 病例组及对照组TGM2基因各SNPs位点基因型频数分布Tab.6 Distribution of genotypic frequencies of SNPs sites of TGM2gene in case group and control group [n（η/%）]

表8 TGM2基因各SNPs位点基因型与精神分裂症阴性临床表型的相关性Tab.8 Association between genotypes of SNPs sites of TGM2gene and negative symptoms of schizophrenia

3 讨 论

在过去的20年中，精神分裂症的遗传学研究获得了较大进展，数百种基因被鉴定与精神分裂症发病密切相关[6]。但是，精神分裂症易感基因本身并不能单独致病，需要和环境因素共同作用而诱发疾病。至于哪些环境因素参与发病，环境因素通过何种途径和机制与遗传因素相互作用而导致疾病的发生目前尚未阐明，这将是未来精神遗传学研究的最重要问题之一。精神分裂症具有自身免疫性疾病的特点，其发病与炎症性细胞因子失衡密切相关。精神分裂症患者存在免疫功能异常，抗精神病药物具有免疫抑制效应。鉴于此，有学者认为精神分裂症可能是一种自身免疫问题，免疫反应可能在精神分裂症发病的遗传与环境因素间发挥桥梁作用。

饮食中的谷蛋白是一种重要的环境风险因子。早在上世纪七十年代，就有学者发现小麦面筋的主要成分谷蛋白与精神分裂症有密切关系。对谷蛋白过敏者易患乳糜泻，成年乳糜泻患者常常伴有精神分裂症临床表现。在不明原因的精神分裂症患者中，未确诊的乳糜泻发病率高达16%。控制精神分裂症患者摄入富含谷蛋白的食品可明显改善精神症状。这些结果提示：针对谷蛋白的免疫反应是精神分裂症发病的重要因素。

本课题组近期研究[7]发现：精神分裂症患者血浆 Anti-Gliadin IgA阳性率、Anti-Gliadin IgA水平与健康对照相比均显著增高，提示谷胶蛋白IgA抗体与中国汉族人群精神分裂症发病密切相关。在IgA阳性个体中，进一步检测其血清中脱酰胺基谷胶蛋 白 衍 生 肽 抗 体（anti-gliadin-related GAF-3X peptides）和TGM2抗体水平，发现Anti-Gliadin（GAF-3X）IgA 和 Anti-TGM2IgA 与健康对照相比均显著降低，提示TGM2可能参与了中国汉族人群精神分裂症的发病。

本研究中，本文作者选择了Bradford等在英国精神分裂症核心家系的连锁不平衡研究中发现的rs2076380、rs7270785、rs4811528 和 s6023526 4个SNPs位点，利用病例－对照关联研究方法，在中国北方汉族人群中探讨TGM2基因与精神分裂症发病的关系，结果显示：TGM2基因的rs2076380、rs7270785、rs4811528和rs6023526位点与精神分裂症发病及临床表型无关联。本研究未能验证Bradford等的阳性研究结果。其中的因素可能为：①TGM2基因是中国汉族人群精神分裂症 相 关 基 因， 但 rs2076380、rs7270785、rs4811528和rs6023526位点并非疾病致病位点，而是与致病位点紧密连锁，不排除TGM2基因其他SNPs位点与精神分裂症相关联；②精神分裂症是一种复杂的多基因遗传病，多个致病的微效基因可能由于各自的作用相对较小而单独分析时难以被检测；③由于不同地域、种族和群体之间存在遗传结构差异，精神分裂症发病存在遗传异质性，TGM2基因不是中国汉族人群精神分裂症候选基因。

虽然本研究未能证实TGM2基因与精神分裂症相关联，但是并不能就此否定TGM2基因与精神分裂症发病的关系。近期研究[8]发现：TGM2的rs6023059位点与女性雌激素结合受体变异导致的双向情感障碍相关。研究[9]发现：TGM2的rs4811528位点与精神分裂症患者血浆IL-2水平相关，提示TGM2可能与精神分裂症患者免疫功能紊乱有关。TGM2广泛分布于全身，脑内最明显。有研究[10－11]表明：TGM2与亨延顿舞蹈症有关，亨延顿舞蹈症蛋白聚合物的交联反应可能部分源于TGM2的活性，亨延顿舞蹈症与精神分裂症在遗传上相关，而亨延顿舞蹈症蛋白聚体的形成并不是导致精神分裂症的重点，脑内TGM2的活性和作用才是关键。如果免疫系统识别了TGM2，那么TGM2分子就会成为脑内各疾病易感区域相关损伤的触发因子。因此，TGM2位点可能不是导致精神分裂症的特异性基因，但可能是一种特殊的致病基因。

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