慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因实时定量检测平台的建立

黄 丹，高贝贝，李 莉，苏晶莹，高 源，闫金松，刘晓晖，邵 静，康志杰

(1.大连医科大学附属第二医院血液科，辽宁大连 116027;2.大连医科大学 公共卫生学院，辽宁 大连 116044)

慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因实时定量检测平台的建立

黄 丹1，高贝贝1，李 莉1，苏晶莹1，高 源1，闫金松1，刘晓晖2，邵 静2，康志杰1

(1.大连医科大学附属第二医院血液科，辽宁大连 116027;2.大连医科大学 公共卫生学院，辽宁 大连 116044)

目的 建立慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)患者BCR-ABL融合基因检测及微小残留病变实时定量监测的诊断平台。方法 依据GenBank中编码P210蛋白的融合基因M(b2a2，b3a3)及ABL的基因序列，分别设计引物及Taqman探针，以BCR-ABL阳性的CML患者cDNA为模板，通过PCR扩增出587 bp的基因片段，连入pMD 18-T载体，制备成标准品并绘制标准曲线，运用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，RQ-PCR)技术监测BCR-ABL转录水平的变化。结果 成功构建BCR-ABL标准品。应用RQ-PCR探针法，以ABL为内参，对CML患者进行BCR-ABL融合基因的检测，得到比较稳定的定量数据，与定性结果一致。结论 自行构建BCR-ABL质粒为标准品，运用RQ-PCR实时监测BCR-ABL融合基因的表达变化，敏感性好，稳定性高，对临床检验具有普遍意义。

慢性粒细胞白血病;BCR-ABL;标准品;实时荧光定量PCR;诊断平台

慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是起源于骨髓多能造血干细胞的恶性增殖性疾病，其细胞遗传学特征是具有Ph染色体 t(9;22)(q34;q11)［1-2］，形成 BCR - ABL 融合基因，该融合基因编码的BCR-ABL融合蛋白具有很强的酪氨酸激酶活性，可抑制髓系细胞的粘附和凋亡，促使细胞不依赖于细胞生长因子而过度增殖，引发大量异常细胞的恶性增殖［3］。近年来，随着分子生物学技术的发展和对发病机制的研究，肿瘤靶向治疗已经成为CML治疗的一线方案［3］，而针对BCRABL融合基因的检测及监测为CML的诊治提供了可靠的分子依据［4-5］。因此，建立稳定、有效、可行的实时定量检测BCR-ABL融合基因的方法是非常必要的［6］。

1 材料和方法

1.1 材 料

试剂及仪器:RNAiso Plus(D9108A)，pMD 18-T Vector(D109A)，限制性内切酶EcoRI(D1040A)，HindIII(D1060A)，质粒纯化试剂盒(DV805A)，PCR引物的合成及高保真PCR试剂盒(DR001A)均购自大连宝生物公司;反转录试剂盒及RQ-PCR试剂盒 RocketScript RT PreMix(AccuPower®)和 Accu-Power®DualstarTM qPCR PreMix，均购自 Bioneer公司。PCR仪为Applied Biosystems®GeneAmp®PCR System 9700和 Applied Biosystems®GeneAmp®PCR System 7500等。

1.2 方 法

1.2.1 引物设计:参照欧洲抗癌工作组多中心实验方法［7］，以国际广泛应用并认可的ABL基因为内参，根据 GenBank人 BCR-ABL(e14a2)cDNA AJ131466、人v-Abl cDNA NM_007313分别设计上下游引物，构建BCR-ABL基因检测标准品，引物及探针为韩国Bioneer公司合成。分别设计检测BCR-ABL融合基因及内参基因的特异性引物及探针，引物设计示意图及具体序列见图1和表1。

图1 BCR-ABL引物设计示意图Fig 1 Design of primers and probes of BCR-ABL

表1 BCR-ABL引物序列Tab 1 Sequences of primers and probes of BCR-ABL

1.2.2 BCR -ABL(S)标准品质粒的构建:提取患者外周血单个核细胞RNA，反转录为cDNA，应用巢式PCR筛查阳性标本［8］，将回收的BCR-ABL片断，插入 pMD 18-T载体中，构建 pMD 18TBCR-ABL(S)质粒作为标准品。通过酶切鉴定后送测序，结果回报正确。扩增体系与条件:10×buffer 5 μL，dNTPs 5 μL，引物各2.0 μL，模板 cDNA 2.0 μL，Taq 酶 0.5 μL，H2O 33.25 μL。94 ℃ 变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，32 个循环。

1.2.3 标准曲线的制作:将构建成功的质粒转化扩增，根据Avogadro常数和核酸的平均分子量进行计算拷贝数，具体为:拷贝数/μL=(ng/μL ×10-9×6.02×1023)/(DNA碱基数×660)。将质粒稀释为 107/μL、106/μL、105/μL、104/μL、103/μL、102/μL和10/μL，制成标准品，通过实时定量绘制标准曲线。

1.2.4 CML患者标本的实时定量PCR检测与分析:提取CML患者外周血单核细胞总RNA，反转录为cDNA作为模板，以ABL为内参，进行实时荧光定量检测，将检测结果与标准曲线对比，得出拷贝数。为了检测的稳定性和准确性，每批实验需设置阴性对照及空白对照，同时设置3复孔，实验体系为20 μL，cDNA 2 μL、Pre Mix10 μL、RoxⅡ0.4 μL、上游引物 1 μL(10 pmol/μL)、下游引物 1 μL、探针 1 μL、水 4.6 μL，反应条件为解链 95 ℃ 5 s，退火 60℃ 30 s，60℃时采集荧光，共40个循环。

2 结果

2.1 pMD 18T-BCR-ABL(S)质粒的构建

以BCR-ABL(e14a2)阳性患者cDNA为模板，以BCR-ABL S-F+R为引物，成功扩增到597 bp目的片段(图2)。将扩增到的片段进行胶回收纯化，与 pMD 18-T Vector连接构建标准品 pMD 18T-BCR-ABL(S)，以EcoR I及Hind Ш双酶切，1.5%琼脂糖凝胶电泳显示378 bp条带，证明扩增引物成功连入pMD 18-T Vector(图3)。将连接产物胶回收纯化送测序，回报序列完全正确，标准品构建成功(图4和5)。

图2 PCR产物电泳图Fig 2 Electrophoretogram of PCR products

图3 酶切图谱Fig 3 Restriction map of standard

图4 pMD 18T-BCR-ABL(S)示意图Fig 4 Diagram of pMD 18T-BCR-ABL(S)

图5 pMD 18T-BCR-ABL(S)测序结果Fig 5 Sequencing result of pMD 18T-BCR-ABL(S)

2.2 标准品的制备及验证

2.2.1 核酸的定量及拷贝数的计算:pMD 18TBCR-ABL(S)质粒DNA定量结果为3040 ng/μL。故根据计算公式得到拷贝数为8.56×1011(copies/μL)。

2.2.2 标准品的制备:将质粒做10倍梯度稀释，数量分别为 8.56 × 107、8.56 × 106、8.56 × 105、8.56 ×104、8.56 × 103、8.56 × 102、8.56 × 101(copies/μL)，以各拷贝梯度样品为模板，进行RQ-PCR扩增，同时设置3复孔及空白对照，图6为不同浓度质粒的扩增曲线，结果显示，不同浓度的模板在PCR扩增后按浓度由高到低的顺序均匀排列，即扩增曲线可以反映起始模板的量，将扩增产物进行1.1%的琼脂糖凝胶电泳，可见明确的目的条带，并随浓度的增加扩增产量增大，证明扩增曲线为特异性扩增。图7为应用质粒标准品绘制标准曲线。结果表明，质粒拷贝数与荧光信号进入设定的阈值时经历的循环数(thresholdcycle，Ct)呈现良好的线性关系，可以用于模板拷贝数的定量。

图6 标准品的扩增曲线Fig 6 Amplification plot of the standards

图7 pMD 18T-BCR-ABL(S)为模板建立的标准曲线Fig 7 Standard curve exhibited a good linear relationship between absorbance and pMD 18T-BCR-ABL(S)concentration

2.3 CML患者标本的实时定量PCR分析

以患者cDNA为模板，以构建的 pMD 18TBCR-ABL(S)为标准品，以ABL为内参，应用Taqman探针法，进行患者BCR-ABL融合基因的检测，可以得到比较稳定的定量数据，与定性结果一致(图8和图9)。

3 讨论

图8 利用RQ-PCR实验体系对慢性粒细胞患者血液标本进行BCR-ABL拷贝数检测Fig 8 Monitoring of BCR-ABL copies in CML patients by RQPCR

图9 RT-PCR检测患者血液标本DNA扩增产物1.1%的琼脂糖凝胶电泳Fig 9 The samples were amplified with RT-PCR and the products were showed in 1.1%Agar

基因变异是肿瘤形成的根本原因，其中一些特定的突变类型会导致特定的肿瘤，如Ph染色体的形成可直接造成慢性粒细胞白血病的发生。自Ph染色体被发现以来，临床广泛应用细胞遗传学方法检测Ph染色体做CML的诊断和疗效监测。然而基因异常可分为多种形式，染色体核型分析在甄别细微染色体异常时，并不能达到预期的效果。近十余年来，分子生物学方法检测BCR-ABL融合基因的应用逐渐普及。BCR-ABL融合基因的水平与临床疗效有很好的相关性［7］，能预先对临床病情变化提出警示，对于白血病微小残留病的监测和及时调整治疗方案都有重要意义，尤其是分子靶向药物的应用，使得分子检测成为CML治疗中不可缺少的一部分，因此，定期检测BCR-ABL融合基因对临床诊疗的意义已经于世界范围内达成共识［9］。

实时定量PCR(RQ-PCR)方法检测灵敏度高，特异性好，能检测到 10-6～10-5个肿瘤细胞，是目前国际上应用检测微小残留病变最普遍的方法，使用实时定量PCR技术监测BCR-ABL分子学水平是评价疗效以及获得完全细胞遗传学反应的最佳方法，但因为已有商品化试剂费用昂贵，故未能广泛应用于临床检验。而以分子生物学技术为基础，自行构建含有BCR-ABL基因的环形质粒为标准品，以国际广泛应用并认可的ABL基因为内参基因，与荧光定量方法相结合，兼顾灵敏性与特异性，经济、快速、稳定，对临床诊断具有潜在价值，值得推广。

目前发现的BCR-ABL融合基因一共有3个亚型［4］，ABL的断裂点始终发生在第2号外显子，而BCR的断裂点分别发生在第13、14号外显子，1号外显子及19号外显子，从而形成了不同的亚型，即M(b2-a2，b3-a2)，m(e1-a2)及 u(e19-a2)，M型编码210 kd的蛋白，主要见于90%以上的CML患者，而m型编码190 kd的蛋白，u型编码230 kd的蛋白，在CML患者中发生率较低。本实验室针对发生于大多数CML患者的M型BCR-ABL融合基因设计引物，成功建立起稳定可行的实时定量PCR检测平台，为CML患者的诊治工作提供了有效的分子支持。

基因检测对临床的诊断及治疗发挥着越来越重要的作用，应用分子生物学方法可以快速建立其他融合基因的特异性检测方法。因此，依托分子生物学实验室，参照欧洲抗癌工作组多中心实验方法，经患者本人同意及伦理委员会审批，利用其BCRABL阳性标本，构建质粒做为标准品，以国际广泛应用并认可的ABL基因为内参基因，以Taqman探针法，设计目的基因引物及探针，应用RQ-PCR技术，监测BCR-ABL融合基因的表达情况，敏感性好，稳定性高，可操作性强，对临床检验具有普遍意义，值得推广。

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［1］Nowell PC HKA.A minute chromosome in human chronic granulocytic leukemia［J］.Science，1960，132(3438):1497.

［2］Heisterkamp NSK，Groffern J.Structural organization of the bcr gene and its role in the Ph，translocation［J］.Nature，1985，315(6022):758-161.

［3］Charles LS.Chronic myeloid leukemia［J］.N Engl J Med，1999，340(17):1330-1340.

［4］Wong S Witte ON.The BCR -ABL story:bench to bedside and back［J］.Annu Rev Immunol，2004，22:247 -306.

［5］Hochhaus AWA.Detection and quantification of residual disease in chronic myelogenous leukemia［J］.Leukemia，2000，14(6):998-1005.

［6］孟凡义.慢性粒细胞性白血病的治疗［J］.新医学，2004，35(7):392-393.

［7］J Gabert EB.Standardization and quality control studies of＇real- time＇quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia-A Europe Against Cancer Program［J］.Leukemia，2003，17(12):2318-2357.

［8］李莉，康志杰，武克宇，等.Ph染色体和Bcr-Abl融合基因的动态监测在慢性粒细胞白血病治疗中的临床意义［J］.临床和实验医学杂志，2012，11(16):1261-1263.

［9］Ou J VJA，Bagg A.Molecular diagnosis and monitoring in the clinical management of patients with chronic myelogenous leukemia treated with tyrosine kinase inhibitors［J］.Am J Hematol，2008，83(4):296 -302.

Development of a diagnosis platform for real time quantitation of BCR-ABL fusion gene in chronic myelogenous leukemia

HUANG Dan1，GAO Bei-bei1，LI Li1，SU Jing -ying1，GAO Yuan1，YAN Jin -song1，LIU Xiao-hui2，SHAO Jing2，KANG Zhi-jie1
(1.Department of Hematology，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China;2.Department of Public Health，Dalian Medical University，Dalian116044，China)

［Abstract］ObjectiveTo improve clinical diagnosis and treatment of chronic myeloid leukemia(CML)，we aim to establish a diagnosis platform for detecting BCR-ABL fusion gene and mornitoring minimal residual disease by constructing a circular plasmid using BCR-ABL fusion gene as a standard.MethodsWe designed primers and Taqman probes specific to BCRABL(b2-a2，b3-a2)and ABL，and used cDNA of the CML patient as the tamplate to amplify a BCR -ABL fragment.The 587bp PCR product of BCR -ABL was cloned into pMD 18T vector and used as a reference standard.The copy numbers was then determined and standard curve derived.The transcriptional expression of BCR/ABL in bone marrow samples from patients was quantitated by real-time quantitative PCR(RQ-PCR).ResultsWe constructed a circular plasmid with BCRABL fusion gene according to the method from cancer groups in Europe.With pMD 18T BCR -ABL plasmid as reference standard and ABL as an internal control，we accurately detected BCR -ABL expression in CML patients using Taqman based RQ-PCR.After further verification on technical feasibility and data reliability，a diagnosis platform for detecting BCR -ABL fusion gene and minimal residual disease in CML patients was then established.ConclusionThe Taqman based RQ -PCR can greatly improve the sensitivity and reliability in detection of BCR -ABL fusion gene expression.With the technical feasibility，the platform could be helpful for the clinical gene diagnosis and provide guidance for CML treatment.

［Key words］chronic myeloid leukemia;BCR-ABL;standard reference;RQ-PCR;diagnosis platform

R446.9

A

1671-7295(2014)01-0013-05

黄丹，高贝贝，李莉，等.慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因实时定量检测平台的建立［J］.大连医科大学学报，2014，36(1):13 -17.

10.11724/jdmu.2014.01.04

大连医科大学附属第二医院青年基金(2011)

黄 丹(1986-)，女，辽宁大连人，技师。E-mail:huangdan860901@126.com

康志杰，主治医师。E-mail:cathie1997@sina.com

2013-09-08;

2013-11-30)