VEGF-C在宫颈癌细胞的表达及其与细胞黏附和侵袭的关系

田小飞，韩志红，王 静，刘爱兰

(陕西省肿瘤医院妇科，陕西 西安 710061)

血管内皮生长因子-C (vascular endothelial growth growth factor-C,VEGF-C)是新近发现的特异性淋巴管生长因子，与肿瘤的淋巴转移相关。VEGF-C对肿瘤淋巴转移的机制，是否也与肿瘤细胞的黏附、侵袭等转移相关生物学行为的影响有关，目前相关研究报道很少。宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤，其发病率在我国妇科恶性肿瘤中居首位。淋巴转移是宫颈癌的重要转移途径，也是影响患者预后的重要因素。对宫颈癌淋巴转移机制的研究，为靶向性阻断宫颈癌淋巴转移的可行性提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

Matrigel(Collaborative Research公司)，ECM胶E1270(Sigma公司)，纤维粘连蛋白FN(Roche公司)，反义VEGF-C寡核苷酸链：5’-CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG-3’，两端各3个碱基进行硫代修饰，目标核苷酸232～251，在5’端标记FITC，随机链序列为：5’-CAGCTCCTGTCCAGCCTCTC-3’，两端各3个碱基进行硫代修饰；阳离子脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen公司，系尹如铁副教授惠赠)；Transwell小室(3428型，孔径8um，Corning-Costar公司),VEGF-C及内参照GAPDH的引物均由华西医院眼科实验室协助设计，其氨基酸序列及其产物长度如下(见表1)。

表1 引物核苷酸序列及长度

2 方法

2.1 应用脂质体介导VEGF-C反义寡核苷酸转染HeLa细胞

人宫颈癌HeLa细胞培养采用高糖DMEM细胞培养基，含有10%的小牛血清，常规培养。将处于对数生长期HeLa细胞，将反义寡核苷酸链、正义链按终浓度为600 nmol/L分别用不含血清和抗生素的高糖DMEM培养基稀释，将LipofectamineTM2000和寡核苷酸比例为2.5∶1比例混合，避光静置20 min后转染细胞，同时以未转染细胞作为对照组。首次转染以5’端标记FAM的反义寡核苷酸链进行转染，转染6 h后加入完全培养基，在荧光显微镜下观察转染效果，通过细胞内荧光多少初步判断转染是否成功。

2.2 肿瘤细胞对细胞外基质的黏附实验

包被基底膜：配制以下3种溶液：10 g/L BSA；50 mg/L Matrigel 1∶2稀释液；10 mg/L FN。水化基底膜：吸取培养板中的残余液体，每孔加入50 ul含10 g/L BSA的无血清高糖DMEM培养液，孵育30 min后接种细胞：调整细胞密度为1×105/ ml，分别将100 ul细胞悬液，接种到包被了BSA、Matrigel和FN的96孔板，每组平行6个样本。MTT比色法检测：测定各组细胞的光吸收值(OD值)，计算细胞黏附率。黏附率=(OD值实验组-OD值BSA组)/OD值BSA组×100%

2.3 细胞体外侵袭力测定(按操作说明书进行)

小鼠成纤维细胞系NIH3T3采用RPMI-1640培养液培养，待长势良好时换无血清培养液培养24 h后，收集上清液备用。200 ul/孔细胞外基质包被Transwell小室底部。6孔板中加入培养基水化基底膜30 min。吸弃培养液，加入1∶1条件培养液和完全培养液2.5 ml于下室。接种转染细胞2×105/孔于上室，培养24 h、48 h，每组设三个复孔。取出小室，用棉签擦去上室中的细胞，酒精固定、苏木素染色、伊红再染色，梯度酒精脱水，取下膜，中性树胶固定封片。在400倍光镜下随机取5个视野计数穿膜细胞数，取其平均值代表侵袭力的值。

2.4 统计学处理

所有资料均用SPSS10.0软件包进行处理，采用t检验和方差分析进行统计学分析，检验水准定0.05，若P<0.05，认为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 VEGF-C在宫颈癌HeLa细胞中的表达

实验中采用阳离子脂质体转染宫颈癌Hela细胞，免疫组化学检测可见VEGF-G在细胞浆内表达，以浆内呈现棕黄色颗粒为阳性(图1)。荧光显微镜下显示VEGF-C转染效率>90%。

A VEGF-C在宫颈癌Hela细胞中的表达400× B FAM标记的反义寡核苷酸转染6 h后Hela细胞400×

3.2 反义寡核苷酸转染前后HeLa细胞黏附能力的变化

从图2可以看出，反义组的黏附率较对照组和正义组明显降低，统计学处理差异具有统计学意义(P<0.05)。而对照组和正义组间也存在差异，但没有统计学意义(P>0.05)。各组细胞对两种细胞外基质的黏附能力也不同，经方差分析，两种基质的黏附能力间存在的差异，具有统计学意义(P<0.05)。

A Hela细胞粘附实验 B 反义寡核苷酸转冻后Hela细胞粘附实验

C 转染后各组细胞粘附率

3.3 寡核苷酸转染前后HeLa细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭小室的多孔滤膜经过HE染色，可以看到细胞质呈粉红色，细胞核呈蓝紫色，穿过微孔滤膜的细胞形态没有变化。三组细胞的侵袭能力，通过计数穿过微孔滤膜的细胞数目来检测，具体见下(图3)。随着作用时间延长，穿过重组基底膜的细胞数是增加的。在各组细胞的比较中，经统计学处理，在各个时间点，反义组和对照组、正义组间的差异具有统计学意义(P<0.05)，而对照组和正义间的差异没有统计学意义(P>0.05)(见表2)。

A 未转染Hela细胞穿膜48 h HE×400 B 反义寡核苷酸转染后Hela细胞穿膜48 h HE×400

表2 不同时间三组细胞的穿膜细胞数

3 讨论

3.1 VEGF-C在肿瘤细胞中的表达

1996年Joukou等[1]利用受体和色谱法，从人类的前列腺癌细胞株PC-3的cDNA文库中，克隆并分离出了VEGF家族的新成员VEGF-C。Ueda等[2]观察16种妇科肿瘤细胞(鳞癌 SKG-I、SKG-II、SKG-IIIa、SKG-IIIb、OMC-1、YUMPTO、QG-U等，腺癌 HOKUG、NUZ、OMC-4、CAC-1等)的VEGF-C的表达和侵袭活性的关系；本实验采用了免疫细胞化学法，直观观察到VEGF-C在宫颈癌HeLa细胞的强阳，宫颈癌HeLa细胞是腺癌细胞，有很强的侵袭和黏附能力。

3.2 VEGF-C反义寡核苷酸对细胞的黏附的影响

肿瘤细胞从母体脱离后，侵袭基底膜及细胞外基质，使肿瘤扩散和转移。已有研究证实了[3]，肿瘤细胞运动能力的强弱与其侵袭能力呈现正相关。肿瘤细胞只有与细胞外基质成分粘连，才能实现肿瘤细胞的侵袭和转移，阻断肿瘤细胞与细胞外基质的黏附过程，可以影响肿瘤的转移。本实验中，检测各组细胞转染了VEGF-C反义寡核苷酸，对细胞外基质(FN)和Matrigel胶(富含层粘连蛋白LN)的黏附能力的改变，可以看到转染了VEGF-C反义寡核苷酸的HeLa细胞组的黏附率明显下降。这说明VEGF-C与细胞对周围基质的黏附能力有关。但具体调节机制还不清楚。曲明阳[4]等人将VEGF-C反义寡核苷酸转染入乳腺癌细胞MDA-MB-435，细胞的黏附和侵袭能力下降，同时也下调了MMP-2蛋白的表达。MMP-2是基质金属蛋白酶家族的重要成员,在多种人类肿瘤中表达，通过调控肿瘤细胞与基底膜的黏附及破坏由细胞间质、基底膜组成的细胞外基质屏障参与肿瘤的转移。

3.3 VEGF-C反义寡核苷酸对细胞的侵袭的影响

体外侵袭的研究方法，人工基底膜实验，现是国内外应用最广泛的体外侵袭模型。Transwell侵袭小室的多孔聚碳酸酯滤膜上的孔径是8ul,被基底膜ECM覆盖后，肿瘤细胞不能自由穿过。肿瘤细胞在由小鼠成纤维细胞NIH3T3，制备的条件培养液的趋化和诱导下，可以穿过多孔滤膜。通过观察穿过Transwell侵袭小室的多孔滤膜的细胞数目，了解细胞的侵袭能力。Stacker[5]等观察到肿瘤细胞穿过重组基底膜的能力与其体内侵袭能力，表现出较好的相关性，因而用来研究体外细胞的侵袭能力。本实验采用Transwell侵袭小室方法，将ECM胶铺在Transwell侵袭小室的多孔滤膜上，能形成与天然基底膜极为相似的基底膜结构。ECM胶，是从小鼠的Engelbreth Holm-Swarm(EHS)sarcoma 中提取的基质成分，含有LN、VI型胶原等。本实验采用小鼠成纤维细胞NIH3T3，起到趋化，计数穿过滤膜的细胞数，观察各组细胞的侵袭能力，转染了VEGF-C反义寡核苷酸组的侵袭力是明显受到抑制。

3.4 VEGF-C与肿瘤的转移机制的关系

肿瘤转移时受多因素影响和多基因调控，与肿瘤细胞自身的生物学特征、肿瘤细胞与周围间质间的相互作用有关。错综复杂的转移过程，可能涉及到多种基因的相互协调、多基因产物的相互作用。VEGF-C促进肿瘤淋巴转移的可能机制[6]：(1)肿瘤细胞分泌的VEGF-C与淋巴管内皮细胞VEGFR-3结合，VEGFR-3开始自身磷酸化，启动淋巴管内皮细胞的增殖，促进肿瘤周围毛细淋巴管的增生和扩张，而淋巴管的数量与淋巴结转移状况呈现正相关。增生的淋巴管没有完整的基底膜，内皮细胞间存在暂时裂隙，淋巴管的通透性增高，利于瘤细胞进入。增生的淋巴管为肿瘤的生长提供了营养，同时增加了瘤细胞与淋巴管的接触面积，使肿瘤细胞的侵袭和转移的机会增加。(2)肿瘤细胞分泌的VEGF-C与自身的VEGFR-3的结合，使肿瘤细胞特异性的黏附到淋巴管内皮细胞上，导致转移开始阶段的发生。(3)VEGF-C作为一种趋化因子，使肿瘤细胞以淋巴管为靶向转移，在一定程度上增加了肿瘤的特异器官的亲和性；而且VEGF-C改变了淋巴管内皮细胞的黏附特性，也改变细胞因子、趋化因子的表达，促进肿瘤细胞的转移播散。VEGF-C激活淋巴内皮，后者分泌某些细胞因子，对肿瘤细胞也产生趋化作用。(4)VEGF-C通过刺激内皮细胞产生一氧化氮NO，调节淋巴管的收缩。(5)VEGF-C作用下，淋巴内皮细胞局部释放旁分泌因子，影响肿瘤细胞的转移相关生物学特性黏附、迁移、侵袭等，从而促进转移。(6)分泌VEGF-C并转移到淋巴结的肿瘤细胞，由于能同时刺激淋巴管和血管内皮细胞的增殖，具有生长优势。

参考文献：

[1] Joukov V,Pajusola K,Kaipainen A,et al.A novel vascular endothelial growth factor,VEGF-C is a ligand for the Flt-4(VEGFR-3) and KDR(VEGFR-2) receptor tyrosine kinases [J].The EMBO Journal,1996,15(2):290-298.

[2]Ueda M,Terai Y,Yamashita Y,et al.Correlation between Vascular endothelial growth facter-C expression and invasion phenotype in cervical carcinomas[J].Int j cancer 2002,98(3):335-343.

[3]王文萍.实用肿瘤转移学[M].辽宁：科学技术出版社，2002.

[4]曲明阳，刑光明，冯秉安.VEGF-C反义寡核苷酸对乳腺癌细胞MDA-MB-435黏附、侵袭能力的影响[J].实用肿瘤杂志，2005，20(1)：21-24.

[5]Stacker SA，Baldwin ME，Achen MG.The role of tumor lym phangiogenesis in metastatic spread[J].FASEB J,2002,16(9)：922-934.

[6]Hsieh CY,Chen CA,Chou CH,et al.Overexpression of Her-2/NEU in epithelial ovarian carcinoma induce vascular endothelial growth factor c by activating NF-kappa B: implication for malignant ascites formation and tumor lymphangiogenesis[J].J Biomed Sci,2004,11(2):249-259.