保肝药物体内活性筛选方法的建立

云南中医学院，云南 昆明 650500

保肝药物体内活性筛选方法的建立

吴爱萍段小花周志宏代蓉淤泽溥*

云南中医学院，云南 昆明 650500

目的建立一种稳定便捷的保肝药物活性筛选方法。方法用CCl4复制小鼠急性肝损伤模型，考察CCl4染毒剂量、染毒时间及染毒途径对实验结果的影响，选择阳性对照药物，多次重复实验来考察方法的稳定性。结果对小鼠一次性腹腔注射0.2% CCl4橄榄油溶液0.1ml/10g.bw，染毒20h后，模型组小鼠血清ALT、AST均高于正常组 (P<0.01)，可成功复制急性CCl4肝损伤模型；联苯双酯组小鼠血清ALT低于模型组(P<0.01)，提示其有保肝降酶作用，故选择联苯双酯作为阳性对照药；经多次方法学考察，确定已建立了稳定的保肝药物活性筛选实验方法。结论对小鼠一次性腹腔注射0.2%CCl4橄榄油溶液0.1ml/10g.bw，染毒20h，可以成功复制结果稳定的小鼠CCl4急性肝损伤模型。

急性CCl4肝损伤模型；保肝作用；活性筛选方法

肝脏被誉为人体的化工厂，在机体代谢中有极其重要的作用。肝脏疾病是人类最常见的疾病之一, 严重威胁着人类健康。许多因素，如病毒、生物、药物、理化、酒精及全身性疾病的影响，都可以导致肝损伤。研究证明，无论何种原因引起的肝脏病变，肝细胞损伤都是其共同的病理基础[1-3]。肝损伤长期存在，往往是导致肝纤维化，甚至肝硬化、肝癌发生的重要始动因素。研究开发具有保肝活性的药物是防治各类肝脏疾病的重要措施之一，为寻找和发现更好的保肝药物，需建立适用于保肝药物活性筛选的研究方法。我们通过多次重复实验，建立了稳定的小鼠四氯化碳急性肝损伤动物模型，成功地应用于保肝药物和活性成分的追踪筛选研究。

1 材料

昆明种小鼠，清洁级，雌雄兼用，体重18～22g。均购自四川省医学科学院实验动物研究所，合格证号：SCXK(川)2008-24。批号：Dossy2010-12。四氯化碳(CCl4)：分析纯，≥99.5%，武汉联碱厂，批号：20040310；益肝灵片： 国药准字Z19994019，每片含水飞蓟宾77mg，四川志远广和制药有限公司，批号：100901；联苯双酯滴丸：国药准字H33020232，1.5mg×250丸/瓶，5粒/次，每日3次；浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号：100409、101004。

2 方法

2.1 染毒物质的确定 保肝药物活性筛选的目的是通过规范化的实验研究方法，确定受试物是否具有保肝降酶作用及其保肝活性成分所在部位，为进一步研究和开发保肝新药提供实验依据。

为了明确受试物中保肝活性成分的存在部位，需建立一种稳定、可靠、重现性好的筛选方法，复制适当的肝损伤动物模型，选择简单易行的检测指标。经查阅文献[1-3]，拟建立小鼠CCl4急性化学性肝损伤模型，用于保肝药物活性追踪筛选。

2.2 CCl4染毒剂量、染毒时间及染毒途径的考察 通过查阅文献[4-7]，小鼠CCl4急性肝损伤模型造模的主要影响因素是染毒剂量、染毒时

间，因此首先考察这两个主要因素。染毒剂量决定于毒物的浓度和给药体积，为了使各组的给药体积一致，本实验采用同体积不同浓度的方法，即染毒剂量由浓度决定。故参考文献[9-12]将CCl4设置了0.05%、0.1%、0.2%三个浓度，给药体积均按0.1ml/10g。染毒时间是指药物进入机体后发挥毒性作用的时间，也是影响毒性的主要因素，故参考文献[9-12]选择12h、16h和20h三个时间点。染毒途径也是必须考虑的，CCl4染毒常用腹腔注射和皮下注射两种染毒途径，但皮下注射常有少量药液从注射部位漏出，影响染毒剂量的准确性，故本实验采用腹腔注射。

[4-7]方法，取昆明种清洁级小鼠100只，雌雄各半，体重18～22g。按体重与性别随机分为10组，即正常对照组和CCl4三个染毒剂量不同染毒时间的9个组(见表1分组)。每组动物均为10只。除正常对照组外，其余各组分别腹腔注射0.05%、0.1%、0.2%三个不同浓度的CCl4橄榄油溶液0.1ml/10g.bw。造模后(禁食不禁水)12h、16h和20h分别摘眼球取血，以5000r/min离心15min，分离血清，按测定试剂盒(赖氏法)操作方法分别测定血清血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)。

2.3 阳性药物的选择 我们首先考虑选择的阳性药物，其主要成分最好为从中药或天然药物得到的活性成分，以利于跟受试样品作比较。通过查阅文献[8]，益肝灵主要成分是水飞蓟宾，而水飞蓟宾为天然药物水飞蓟提取分离得到的活性成分。故选择益肝灵作为阳性药物进行预试验。

2.3.1 以益肝灵作为阳性药物 参考文献[9]，取昆明种清洁级小鼠36只，雌雄各半，体重18～22g。按体重与性别随机分为3组，即正常对照组、肝损伤模型组、益肝灵组，每组动物12只。益肝灵组灌胃给予相应药物，其余两组给予等体积1% CMC-Na，灌胃给药体积均为0.1ml/10g.bw，1次/d，连续用药6d，第6日给药后30min，除正常对照组外，其余各组均腹腔注射0.1%的CCl4橄榄油溶液0.1ml/10g.bw，造模后禁食不禁水16h。同时第7日再给药一次，末次给药后30min，摘眼球取血，同前方法离心及分离血清，测定血清ALT、AST。

2.3.2 以联苯双酯作为阳性药物 参考文献[10]方法，取昆明种清洁级小鼠45只，雄性，体重18～22g。按体重与性别随机分为3组，即正常对照组、肝损伤模型组、联苯双酯组，每组动物15只。联苯双酯组灌胃给予相应药物，其余两组给予等体积1% CMC-Na，灌胃给药体积均为0.1ml/10g.bw，1次/d，连续用药6d，第6日给药后30min，除正常对照组外，其余各组均腹腔注射0.2%的CCl4橄榄油溶液0.1ml/10g.bw，造模后禁食不禁水20h。同时第7日再给药一次，末次给药后30min，摘眼球取血，同前方法离心及分离血清，测定血清ALT。

3 结果

3.1 CCl4不同染毒剂量及不同染毒时间对小鼠血清ALT、AST的影响 0.05%染毒剂量的三个不同时间组小鼠血清ALT、AST与正常对照组比较，差异无统计学意义，表明对小鼠腹腔注射一次0.05%CCl4尚不能引起小鼠急性肝损伤；0.1%染毒剂量的三个不同时间组小鼠血清ALT均高于正常对照组，差异有非常显著性意义(P<0.01)，但AST要16h后才升高；0.2%染毒剂量的三个不同时间组小鼠血清ALT、AST在三个时间点均高于正常对照组，差异有非常显著性意义(P<0.01)。见表1。

表1 CCl4不同染毒剂量及不同染毒时间对小鼠血清ALT、AST的影响

注：与正常组相比：△P<0.05，△△P<0.01

3.2 益肝灵对小鼠CCl4急性肝损伤模型ALT、AST的影响 模型组小鼠血清ALT、AST高于正常对照组，差异有非常显著性意义(P<0.01)，表明造模成功；益肝灵组小鼠血清ALT、AST与模型组比较，无统计学意义；提示益肝灵在所用剂量未显示出保肝降酶作用。见表2。

表2 益肝灵对小鼠CCl4急性肝损伤模型ALT、AST的影响

注：与正常组相比：△△P<0.01

由于上述实验所选择药物未显示出药效，通过查阅文献，我们发现文献中多选择联苯双酯作为阳性药物，因此以联苯双酯为阳性药物进行预试验，为正式实验选择合适的阳性药物及确定其剂量。

3.3 联苯双酯对小鼠CCl4急性肝损伤模型ALT的影响 模型组小鼠血清ALT高于正常对照组，差异有非常显著性意义(P<0.01)，表明造模成功；联苯双酯组小鼠血清ALT低于模型组，差异有非常显著性意义(P<0.01)。见表3。

表3 联苯双酯对小鼠CCl4急性肝损伤模型ALT的影响±s)

与正常对照组相比：△△P<0.01；与模型组相比：**P<0.01

4 讨论

对小鼠进行腹腔注射一次CCl4橄榄油，血清ALT、AST随着CCl4染毒剂量的增加而升高：①对小鼠进行0.05%CCl4不同染毒时间处理，小鼠血清ALT、AST未见明显变化，表明小鼠腹腔注射一次0.05%CCl4，剂量偏小，尚不能成功复制急性肝损伤模型。②对小鼠进行0.1%CCl4不同染毒时间处理，除染毒12h小鼠血清AST未见明显变化外，染毒12h小鼠血清ALT及染毒16h、20h小鼠血清ALT、AST均明显升高；表明0.1%CCl4可以复制轻度急性肝损伤模型，但染毒时间延长至20h，ALT未见明显升高，反而降低。③对小鼠进行0.2%CCl4染毒12h、16h及20h，小鼠血清ALT、AST均明显升高，均可成功复制急性肝损伤模型，且造成的肝损伤程度较为适中、稳定。故我们认为：染毒剂量和染毒时间这两个因素中，剂量因素更为重要。对小鼠一次性腹腔注射0.2%CCl4橄榄油溶液0.1ml/10g.bw，染毒20 h复制的模型，肝损伤程度较为合适，易于反映出药物的保肝降酶作用，将在后续的保肝药物活性追踪筛选实验中采用。

对于阳性药物的选择，在益肝灵和联苯双酯这两个药物中，联苯双酯显示出良好的保肝降酶作用，因此选择联苯双酯作为保肝实验的阳性对照药。

参考文献

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2010年度国家自然科学基金项目獐牙菜苦苷在水中的热转化产物与青叶胆抗肝炎功能的相关性研究 项目编号：81060338。

吴爱萍(1981～)，女，云南人，云南中医学院硕士研究生，研究方向：中药药理与应用。

淤泽溥，药理学教授，E-mail：yuzepu@126.com

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1007-8517(2014)08-0031-02

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