Preparation of AChE/IL-GR/CHI/GCE Enzyme Electrode and Its Application for Chlorpyrifos Pesticide*

ZHENG Yingying，LIU Zhimin，LI Jie，ZHAN Haijun

(College of Chemistry and Chemical Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China)

Preparation of AChE/IL-GR/CHI/GCE Enzyme Electrode and Its Application for Chlorpyrifos Pesticide*

ZHENG Yingying，LIU Zhimin*，LI Jie，ZHAN Haijun

(College of Chemistry and Chemical Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China)

According to the special properties of functionalized ionic liquid modified graphene(IL-GR)，IL-GR was first immobilized on the glass carbon electrode via chitosan(CHI)cross-linking，Finally，acetylcholinesterase (AChE)can be immobilized on the composite film by adsorption.A novel biosensor for detecting organophosphorus pesticides enzyme biosensor(AChE/IL-GR/CHI/GCE)was developed and was used for the determination of chlorpyrifos.Different technologies were employed to study the construction process and the electrochemical properties of the biosensor.Linear relationship between the inhibition percentage(I%)and logarithm of concentration of chlorpyrifos was found in the range of 1.0×10－10mol/L～1.0×10－5mol/L，and the detection limit was calculated to be about 7.0×10－12mol/L(S/N=3).The recoveries of chlorpyrifos in vegetable were from 92.3%to 108.6%.Key words:enzyme electrode;graphene;ionic liquid;acetylcholinesterase;chlorpyrifos

随着现代农业的发展，越来越多的农药被用于农业生产，其中有机磷(OPs)农药是目前使用最为广泛的品种，其高毒性和高残留性直接危害了人民健康。因此，建立快速、灵敏的OPs检测方法显得非常必要。近年来基于乙酰胆碱酯酶(AChE)的生物传感器已在有机磷农药残留检测方面得到了很好的应用，相对于传统的气相色谱和液相色谱法，生物传感器具有简单、快速、实用、可靠、灵敏等优点［1－2］。

随着纳米科技的发展，将不同性能的纳米材料如Ag［3］、Pt［4］等贵重金属以及碳纳米管［5］、ZrO［6］2，等引入生物传感器已成为研究热点。石墨烯(Graphene)是由sp2杂化碳原子构成的二维蜂窝状结构的一种碳材料，具有比表面积大、导电性强及电催化性能好等优点，目前已用作制备电化学传感器的电极材料［7－8］。但石墨烯片与片之间有较强的范德华力，易团聚，从而限制了它的广泛应用。因此，寻求一种既能有助于石墨烯分散又不影响其与基底电极快速电子交换的媒介是研究者们关注的焦点。研究发现离子液体对石墨烯间堆积作用具有屏蔽作用，可有效提高石墨烯的分散性［9］。本研究首先制备氨基功能化离子液体修饰石墨烯(IL-GR)，然后采用壳聚糖(CHI)分散IL-GR，制备玻碳修饰电极(ILGR/CHI/GCE)，利用其表面大量的氨基静电吸附组装AChE，制得新型OPs检测酶电极(AChE/IL-GR/ CHI/GCE)，并用于卷心菜样品中OPs的代表—毒死蜱的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Prestige－21傅立叶变换红外光谱仪(日本岛津公司);UV－2450紫外可见分光光度计(日本岛津公司);Hitachi－800透射电子显微镜(日本日立公司);CHI660E电化学工作站(上海辰华仪器公司)，玻碳电极(GCE，Φ=3 mm)及其修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂丝电极为对电极;所有实验均在室温下进行，所有的电位均相对于SCE。

氯化乙酰胆碱(ATCl，Sigma);乙酰胆碱酯酶(AChE，C3389，236 U/mg，Sigma);壳聚糖(CHI，Sigma);毒死蜱(纯度96.2%，北京北研馨绿生物技术有限公司);石墨粉(国药集团化学试剂有限公司)。磷酸盐缓冲溶液(PBS)由磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制而成。其他试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 氨基功能化离子液体(IL-NH2)及功能化离子

液体修饰石墨烯(IL-GR)的制备

参照文献［10］，N－甲基咪唑和3－溴丙胺盐酸盐以等摩尔比加入到无水乙醇中，氮气保护下回流24 h，产物除去溶剂及未反应物后用少量水将其溶解，加入KOH，调溶液pH值为10.0左右。所得溶液通过减压蒸馏除去大部分水，用乙醇－四氢呋喃(体积比为1∶1)混合溶剂提取产物，收集滤液，最后真空干燥至恒重，即得黄色黏稠状氨基功能化离子液体(IL-NH2)。

采取文献方法合成石墨氧化物(GO)［11］，然后合成功能化离子液体修饰石墨烯(IL-GR)。具体如下:100 mL GO(1 mg/mL))分散液中加入0.35 g KOH和0.2 g IL-NH2，超声均匀，然后80℃下回流24 h，最后加入0.3 mL的水合肼，80℃下再回流2 h。所得产物洗至中性，60℃干燥12 h，即得修饰石墨烯(IL-GR)。

1.3 AChE/IL-GR/CHIT/GCE修饰电极的制备

将CHI溶解在HAc溶液中，制得0.5%(w/v) CHI溶液，然后将2.0 mg的IL-GR加入到10 mL上述分散液中，超声分散2 h后得到IL-GR/CHI分散液。

玻碳电极(GCE)依次用金相砂纸和Al2O3粉在麂皮上打磨并超声清洗。将5 μL的IL-GR/CHI分散液滴加到电极表面，冰箱中放置12 h，然后滴加5 μL的AChE。过夜晾干即得乙酰胆碱酯酶电极，记为AChE/IL-GR/CHI/GCE，电极不用时置于4℃冰箱中保存.

1.4 检测方法及抑制率计算

采用DPV法检测毒死蜱。在含1.0 mmol/L ATCl(pH 8.0 PBS)溶液中，采用三电极系统:修饰酶电极为工作电极，SCE为参比电极，铂丝电极为对电极;在0.2 V～0.8 V之间进行DPV扫描，记录DPV曲线，确定原始响应电流。然后将其置于不同浓度的毒死蜱溶液中浸泡12 min，相同条件下测定酶电极在底物ATCl中的响应电流。

乙酰胆碱酯酶能够催化底物氯化乙酰胆碱(ATCl)水解，催化活性受有机磷农药毒死蜱的抑制，导致水解产物浓度减小，故电流减小。农药的浓度越大，电流减小的越显著，即对酶的抑制率增加。抑制率可由下式计算［12］:

抑制率(I%)=［(I0－I1)/I0］×100%

I0为ATCl在AChE/IL-GR/CHI/GCE上的响应电流，I1是抑制后ATCl在AChE/IL-GR/CHI/GCE的响应电流。

2 结果与讨论

2.1 谱学表征

2.1.1 GO、GR和IL-GR的红外及紫外表征

图1(a)为GO、GR和IL-GR的红外光谱图。从图中可看出，1071 cm－1和1370 cm－1的峰分别对应C—O的伸缩振动及C—O—H伸展峰，1725 cm－1处对应C=O伸缩振动，1622 cm－1处对应于未被氧化的石墨的骨架振动。经水合肼还原后，上述特征峰基本消失，表明GO已转变成了GR。IL-GR红外谱图中，新增加的2940 cm－1和2840 cm－1分别对应CH3(N)以及CH2(N)的伸缩振动吸收峰，而1164 cm－1归属于平面咪唑环的伸缩振动吸收峰，说明IL-NH2已成功的接到石墨烯上［13］。

图1(b)为GO、GR和IL-GR的紫外光谱图。图中显示GO的最大吸收波长在228 nm，而GR和ILGR的最大吸收波长分别在270 nm和266 nm。上述结果与文献报道结果基本一致［14］。

图1GO、GR和IL-GR的红外光谱图及紫外谱图

2.1.2 IL-GR的电镜表征

图2为IL-GR的透射电镜图，从图中可看出ILGR呈鳞片状薄层结构。

图2IL-GR的透射电镜图

2.2 修饰电极的电化学表征

2.2.1 不同电极的循环伏安图

不同电极在5.0 mmol/L K3Fe(CN)6(含有0.1 mol/L KCl)溶液中的循环伏安曲线如图3所示。与裸玻碳电极(曲线a)相比，IL-GR/CHI/GCE修饰后的电极峰电流增大(曲线b)，这归因于修饰石墨烯较大的比表面积和良好的导电性。然而，当把酶AChE固定在IL-GR/CHI/GCE修饰的电极表面时，电流反而减小(曲线c)，这主要是因为酶分子不具有导电性，阻碍了界面电子转移，同时也说明AChE被成功地固定到电极表面。

2.2.2 AChE/IL-GR/CHI/GCE的动力学研究

图35 .0 mmol/L［Fe(CN)6］3－/4－在(a)GCE、(b)IL-GR/CHI/GCE和(c)AChE/IL-GR/CHI/GCE电极上的循环伏安行为

实验中通过循环伏安法考察了AChE/IL-GR/ CHI/GCE酶电极的扫描速度与峰电流之间的关系。结果表明，随着扫速不断增大，其氧化峰电流和还原峰电流均逐渐增大，在50 mV/s～200 mV/s，氧化峰电流(Ipa)以及还原峰电流(Ipc)与扫速的平方根(ν1/2)均呈良好的线性关系，线性方程为:Ipa=－455.78ν1/2－10.35(r=0.999);Ipc=495.20ν1/2+ 36.66(r=0.998)，说明该电极上的氧化－还原反应受扩散控制［15］。

2.3 实验条件的优化

2.3.1 pH的优化

溶液的pH值决定固定AChE的生物活性，图4显示了pH值对1.0 mmol/L ATCl在AChE/IL-GR/ CHI/GCE上响应电流的影响。可以看出，当溶液的pH为6.5～8.0时，氧化电流随pH的增大而增大，至pH为8.0时，响应电流达到最大，过此，则氧化电流反而下降。本实验选择pH为8.0，以获得最大响应电流。

图4pH对酶电极响应的影响

2.3.2 酶用量的优化

酶的固定量影响生物电极的响应信号。实验在含有1.0 mmol/L ATCl(pH 8.0 PBS)中考察了固定不同量的酶对响应信号的影响。如图5所示，当酶固定量达到0.3 U时，响应电流值达到最大。当酶量再增加时，酶层变厚，阻碍了酶促反应产物向电极表面的扩散，降低了灵敏度。因此，实验选择酶的固定量为0.3 U。

图5 酶用量对酶电极响应的影响

2.3.3 IL-GR用量的优化

研究了IL-GR在CHI分散液中的用量对生物电极响应电流的影响。如图6所示，当IL-GR的(mIL-GR∶VCHI)增加时，响应电流逐渐增加;当浓度达到0.15 mg/mL时，响应电流最大;再增加用量，响应电流开始降低。这也许是由于电极表面修饰层厚度过大，阻碍了酶促反应产物硫代胆碱的传质以及与电极的电子交换。因此实验选择IL-GR浓度为0.15 mg/mL。

图6IL-GR复合物浓度对酶电极响应的影响

2.3.4 抑制时间的选择

毒死蜱对乙酰胆碱酯酶有抑制作用，随着抑制时间的延长，AChE的活性降低。实验中对抑制时间进行了优化，如图7结果表明，当抑制时间小于12 min时，酶的相对活性随抑制时间的延长迅速降低，当抑制时间大于12 min后，酶的抑制率趋向一个稳定值，故本实验中抑制时间选择为12 min。

图7 农药的抑制率与作用时间的关系

2.4 毒死蜱的检测

在优化的实验条件下，AChE/IL-GR/CHI/GCE在不同浓度的毒死蜱溶液中的差分脉冲伏安图如图8(a)所示。由图可看出，AChE/IL-GR/CHI/GCE电极在被毒死蜱农药抑制后，其在底物中的响应电流减小。且农药的浓度越大，抑制作用越明显，酶电极在底物中的响应电流越小。以抑制率(I%)对毒死蜱浓度(c，mol/L)的负对数作图，如图8(b)所示，抑制率与毒死蜱浓度在1.0×10－10mol/L～1.0×10－5mol/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为:I% =120.76+11.31lgc，相关系数为0.9875，检出限为7.0×10－12mol/L(S/N=3)。

图8电极在不同浓度毒死蜱溶液中的差分脉冲伏安图(a)及AChE抑制率与毒死蜱浓度的负对数关系图(b)

本文建立的酶电极与其他OPs检测酶电极性能的比较结果见表1。结果表明，本法制备的酶电极对Ops检测的线性范围、检测限及检测时间优于大部分报道的酶电极。较低的检测限可能归因于电极表面固定的修饰石墨烯(IL-GR)具有较大的比表面积，因此对Ops具有较强的选择富集能力，从而大大降低了检测限。而IL-GR良好的导电能力提高了电极表面电子的传导速率，因此缩短了检测时间。

表1 本方法酶电极与其他酶电极的性能对比

2.5 实际样品检测

取10 g新鲜卷心菜菜叶，研碎后置于表面皿中，吸取100 μL 10－5mol/L毒死蜱标准溶液喷撒于菜叶上，加盖放置10 h后用丙酮萃取样品中的毒死蜱，过滤并转移至50 mL的容量瓶中得到样品溶液。样品溶液进行加标回收率实验，回收率的范围在92.3%～108.6%之间。结果表明该酶电极可用于实际样品的检测，并具有很好的效果。

2.6 电极制备的一致性和稳定性

用相同方法制备的6根酶电极测定6份相同的农药样品(5.0×10－8mol/L)，测得抑制率的相对标准偏差RSD(Relative Standard Deviation)为4.8%，表明酶电极的制作工艺具有较好的一致性。固定的酶活性在二周后仍能保持原来的93%，一个月后仍可保持88%，表明酶电极具有很好的稳定性。

3 结论

提出了一种基于功能化离子液体修饰石墨烯固定乙酰胆碱酯酶的新型生物电极，并将其用于农药毒死蜱的测定。此传感界面能有效保持酶的活性，使酶电极具有良好的响应性能。该电极制作简单，操作方便，为有机磷农药提供了新的检测方法。

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郑莹莹(1987－)，女，硕士研究生，研究方向为电化学生物传感器，zhengyingying228@163.com;

刘志敏(1970－)，女，博士，教授，河南省教育厅学术技术带头人，河南省教育厅青年骨干教师，主要从事电化学及生物传感器研究，zhimin@haut.edu.cn。

AChE/IL-GR/CHI/GCE结构酶电极的研制及其对毒死蜱农药的检测*

郑莹莹，刘志敏*，李婕，展海军
(河南工业大学化学化工学院，郑州450001)

利用氨基功能化离子液体修饰石墨烯(IL-GR)的独特性质，以壳聚糖(CHI)为交联剂，首先在玻碳电极表面固定IL-GR，然后吸附乙酰胆碱酯酶(AChE)制得新型有机磷检测酶电极(AChE/IL-GR/CHI/GCE)，并用于卷心菜样品中毒死蜱农药残留的测定。采用透射电镜(TEM)表征了IL-GR的形貌，采用循环伏安法(CV)和差示脉冲伏安法(DPV)研究了酶电极的电化学性质。结果表明，在优化的实验条件下，抑制率(I%)与毒死蜱浓度的对数在1.0×10－10mol/L～1.0×10－5mol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为7.0×10－12mol/L(S/N=3)。测定了卷心菜中毒死蜱的含量，回收率为92.3%～108.6%。关键词:酶电极;石墨烯;离子液体;乙酰胆碱酯酶;毒死蜱

TP212.2

A

1004－1699(2014)04－0426－06

2013－12－18修改日期:2014－03－19

C:7230J

10.3969/j.issn.1004－1699.2014.04.002

项目来源:国家自然科学基金资助项目(21275039);河南省高校青年骨干教师基金资助项目(001135)