载三氧化二砷壳聚糖微球的制备、表征及释药性能

张亮 王靖 刘昌胜 黄晓春* 陈统一

(1.复旦大学附属中山医院骨科，*康复医学科，上海 200032；2.华东理工大学医用生物材料教育部工程研究中心，上海 200237)

三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)的药用历史悠久，除作为早幼粒白血病的经典抗肿瘤药物外，它还可促进乳腺癌、前列腺癌、骨肉瘤和尤文肉瘤等多种实体肿瘤细胞的凋亡[1-2]。研究[3-4]表明1～2 μmol/L浓度的As2O3就能有效抑制骨肉瘤和尤文肉瘤细胞的增殖。

载As2O3磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)在骨肿瘤手术中修复重建骨缺损的同时，可抑制局部肿瘤生长。但CPC直接载荷As2O3会延长骨水泥的固化时间并降低力学强度，其药物释放往往呈爆发性，难以缓慢持续地释药[5]。壳聚糖由甲壳素脱乙酰化形成，具有生物可降解性、生物相容性和分解产物无毒性等特点，因此优于工业生产的其他有机共聚物[6]。壳聚糖的三聚磷酸钠交联产物带正电荷，不易溶解、溶胀较小，性质较为稳定。以三聚磷酸钠为离子凝胶剂制备的壳聚糖微球的水溶性、载药性能及药物缓释效果均较好[7-8]。本研究将壳聚糖微球作为As2O3的载体，探讨载As2O3壳聚糖微球的制备工艺，并观察其表征和体外药物释放性能，为后期复合材料的研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1 药品与试剂 壳聚糖(上海伟康有限公司)，As2O3(北京双鹤药业)，三聚磷酸钠、丙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫脲、氢氧化钾和盐酸(上海凌峰化学试剂有限公司)。

1.2 仪器 S23-2恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)，微胶囊成型装置(上海理工大学)，透析袋15000(上海源聚生物科技有限公司)，FD-3真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)，AFS-930双道原子荧光光度计(北京吉天仪器有限公司)，AJ-5805注射泵(上海安吉电子设备有限公司)，TE200-U倒置显微镜(日本尼康公司)，Nicolet 5700傅立叶变换红外光谱(Fourier transform infrared，FT-IR)仪(美国Thermo公司)，X-射线衍射仪(德国Bruker公司)。

1.3 载As2O3壳聚糖微球的制备 称取一定量的壳聚糖粉末至烧杯，加入离子水，边搅拌边加入冰醋酸；等溶液透明缓慢加入As2O3，过滤去除不溶物质后静止去泡，配制成2％壳聚糖溶液。用真空注射器吸取5 mL壳聚糖溶液加入到注射器，将注射器加载在微球成型装置上。注射泵以90 mm/h的注射速度加载，电压37～39 kV，将壳聚糖溶液滴加到50 mL三聚磷酸钠和丙酮的混合液中制成微球。微球迅速转移，并梯度淋洗至7 mL离心管冷冻过夜，冷冻干燥1 d。

1.4 载As2O3壳聚糖微球的包封率测定 微球成型操作前另取5 mL壳聚糖溶液，并于微球成型操作后收集含载药微球溶液的上清液，采用原子荧光法分别检测壳聚糖溶液和上清液中砷的含量。包封率=(壳聚糖溶液中总的砷含量-上清液中砷含量)/壳聚糖溶液中总的砷含量×100％。

1.5 载As2O3壳聚糖微球的表征观察 分别于光镜和电镜下观察载药微球的成球效果，并进行粒径分析、FT-IR分析和X-射线衍射分析。

1.6 药物体外释放 根据中国药典二部配制模拟体液，取30 mg含1％ As2O3的壳聚糖微球置入50 mL模拟体液中，置入37 ℃恒温箱内。于0.5、1、1.5、2、4、8、12和24 h各取3 mL样本，采用原子荧光法检测砷的含量。每次取样后分别补充3 mL模拟体液。

2 结 果

2.1 包封率测定 载As2O3壳聚糖微球的包封率为(87.3±6.5)％。

2.2 成球效果 载As2O3壳聚糖微球在倒置显微镜和扫描电镜下成球效果较好，微球粒径较小，大小基本均一，分布较满意，冻干后微球表面稍有褶皱。见图1～2。

图1 倒置显微镜下载As2O3壳聚糖微球观察结果(A：×20；B：×100)

图2 扫描电镜下载As2O3壳聚糖微球的成球效果

2.3 粒径分析 载As2O3壳聚糖微球的粒径为10～500 μm，平均(239.5±11.2)μm。见图3。

2.4 FT-IR分析 载As2O3壳聚糖微球和壳聚糖的FT-IR有明显差异。与壳聚糖原料粉末的FT-IR比较，壳聚糖与三聚磷酸钠作用后，3447.7 cm-1羟基伸缩振动峰移到了3405.7 cm-1，1636.1 cm-1出现了尖峰，1596.5 cm-1的峰移到了1541.2 cm-1，1257 cm-1处羟基弯曲振动减小，说明与三聚磷酸钠交联后，壳聚糖微球的结构发生了变化，形成了较强的分子间和分子内氢键。见图4。

图3 载As2O3壳聚糖微球粒径分析

CS：壳聚糖，CM+As：载As2O3壳聚糖微球

2.5 X-射线衍射图谱分析 壳聚糖原料粉末的特征峰有2θ=10.1°和19.9°。在壳聚糖微球中未出现这种特征峰，取而代之的是微球结晶度明显降低所形成的馒头峰，表明三聚磷酸钠和壳聚糖之间发生了较强的相互作用。见图5。

CM+As：载As2O3壳聚糖微球；CS：壳聚糖粉末；CM：空白壳聚糖微球

2.6 药物体外释放 载As2O3壳聚糖微球置入模拟体液中的4 h内，药物快速释放，之后药物释放量平缓上升。24 h内As2O3累积释放量为(30.8±0.5)％。同时，模拟体液中As2O3药物浓度维持在(2.3±0.1)～(4.7±0.1)μmmol/L。见图6。

图6 载As2O3壳聚糖微球的药物释放曲线

3 讨 论

壳聚糖是一种天然聚阳离子碱性多糖，是甲壳素脱乙酰基衍生物，来源广泛，可从虾蟹壳中大量提取，且价格低廉。它具有多种生物活性，能与活体组织相容，不会引起过敏和排斥反应；其降解产物也能完全地被人体吸收，无不良反应，因此，壳聚糖适于作为缓控释药物的辅料[6]。壳聚糖包封药物后，可使药物释放减慢、疗效延长，不良反应减少。壳聚糖微球制备的方法有乳化分散法、油相干燥法、喷雾干燥法、交联聚合法和凝聚法等[6]。本研究采用静电液滴法制备壳聚糖微球，以含As2O3壳聚糖溶液为原料液，三聚磷酸钠和丙酮的混合液为凝胶浴，结果显示，该法制备的微球成球效果良好。研究[7]表明，高压静电发生技术制备载药壳聚糖微球具有工艺简便、制备条件温和、效率高、速率快、生物物质活性损失少等优点。

在高压静电场中，壳聚糖溶液克服黏滞力和表面张力，以液滴状落入凝胶浴，通过壳聚糖阳离子与三聚磷酸根阴离子之间的电荷作用，使壳聚糖微球从溶液中沉淀析出。冻干后的载药微球不粘连，再次分散性良好，这得益于其表面的正电荷；静电斥力的存在使得微球在较长时间内保持稳定，且壳聚糖微球与三聚磷酸钠交联后，形成了较强的分子间和分子内的氢键，也使得载药微球不易溶解，更加稳定[8-9]。

本研究中，FT-IR和X-射线衍射分析也表明，三聚磷酸钠和壳聚糖之间发生了较强的相互作用，壳聚糖结晶程度降低。微球成形速度较快时，壳聚糖分子链来不及进行充分的有序结晶排列；此外，交联后的壳聚糖结构较复杂，部分羟基参与反应，破坏了原来壳聚糖分子的规整性，使得交联后壳聚糖的晶相区减少。这些交联固化后的反应导致了壳聚糖结晶程度的降低，使壳聚糖接近于无定形，因而提高了壳聚糖分子链亲水性，使得载药壳聚糖微球的水溶性更强[10]。

壳聚糖内具有一定的活性基团，可以结合药物，使药物大量分布于交联结构内并缓慢释放。因此，包封在壳聚糖微球内的药物具有明显的缓释、控释或延时释药的特征[8,11]。Shavi等[12]在应用载阿那曲唑壳聚糖微球抗乳腺癌治疗的研究中发现，壳聚糖微球经三聚磷酸钠交联固化后，其药物释放在最初4 h内较为迅猛，之后则释放平缓，48 h内药物累积释放量为(73.04±1.6)％。本研究中，含1％ As2O3的载药壳聚糖微球药物释放也于4 h内快速上升，随之缓慢增加；虽然24 h药物累积释放量仅为30％左右，但同时，模拟体液中As2O3的浓度维持于2～5 μmmol/L，已达到抑制骨肿瘤细胞增长所需药物浓度的要求[3-4]。

综上所述，采用静电液滴法制备载As2O3壳聚糖微球工艺简单可靠，所得载药微球水溶性较好，表征较为满意，包封率高，药物释放较为平缓，在载药微球复合型骨修复材料的研究及应用中具有潜在的优势。

[1]Kritharis A,Bradley TP,Budman DR.The evolving use of arsenic in pharmacotherapy of malignant disease[J].Ann Hematol,2013,92(6):719-730.

[2]Wang Y,Wei Y,Zhang H,et al.Arsenic trioxide induces apoptosis of p53 null osteosarcoma MG63 cells through the inhibition of catalase[J].Med Oncol,2012,29(2):1328-1334.

[3]Jung HS,Kim HS,Lee MJ,et al.Arsenic trioxide concentration determines the fate of Ewing's sarcoma family tumors and neuroblastoma cells in vitro[J].FEBS Lett,2006,580(20):4969-4975.

[4]黄晓春,李泽兵,陈增淦,等.活细胞实时成像技术研究抗坏血酸(AA)协同砷剂抗人骨肉瘤MG-63的体外疗效[J].复旦学报(医学版),2012,39(6):649-652.

[5]Bose S,Tarafder S.Calcium phosphate ceramic systems in growth factor and drug delivery for bone tissue engineering:a review[J].Acta Biomater,2012,8(4):1401-1421.

[6]Islam MA,Firdous J,Choi YJ,et al.Design and application of chitosan microspheres as oral and nasal vaccine carriers:an updated review[J].Int J Nanomedicine,2012,7: 6077-6093.

[7]Mi Y,Su R,Fan DD,et al.Preparation of N,O-carboxymethyl chitosan coated alginate microcapsules and their application to Bifidobacterium longum BIOMA 5920[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl,2013,33(5):3047-3053.

[8]Martins AF,de Oliveira DM,Pereira AG,et al.Chitosan/TPP microparticles obtained by microemulsion method applied in controlled release of heparin[J].Int J Biol Macromol,2012,51(5):1127-1133.

[9]Zeng W,Huang J,Hu X,et al.Ionically cross-linked chitosan microspheres for controlled release of bioactive nerve growth factor[J].Int J Pharm,2011,421(2):283-290.

[10]Estevinho BM,Rocha FA,Santos LM,et al.Using water-soluble chitosan for flavour microencapsulation in food industry[J].J Microencapsul,2013,30(6):571-579.

[11]Park JM,Lee SY,Lee GH,et al.Design and characterisation of doxorubicin-releasing chitosan microspheres for anti-cancer chemoembolisation[J].J Microencapsul,2012,29(7):695-705.

[12]Shavi GV,Nayak UY,Reddy MS,et al.Sustained release optimized formulation of anastrozole-loaded chitosan microspheres:in vitro and in vivo evaluation[J].J Mater Sci Mater Med,2011,22(4):865-878.