丝裂原活化蛋白激酶与核因子-κB在碳酰氯吸入性肺损伤中的作用

邵义如 申捷 袁震 何岱昆

(复旦大学附属金山医院化学伤害医疗救治中心重症监护室，上海 201508)

碳酰氯(俗称光气)作为一种重要的化工原料，全球年产量超过200万吨。碳酰氯吸入可导致吸入性肺损伤，甚至急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。随着对碳酰氯吸入性肺损伤的发病机制的研究的深入，将有助于ARDS的早期诊断和特异性治疗，对降低碳酰氯吸入性肺损伤患者的病死率也有重要意义。研究[1-2]发现，在内毒素、高氧、烧伤、缺血再灌注及机械通气等引起的肺损伤中，活化的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)使转录因子如激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)、核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)等磷酸化，这些转录因子再作用于靶基因5'端的一些调控序列(如转录因子AP-1结合位点、CAMP反应元件等)，调节基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases 9，MMP-9)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(inerleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素(inerleukin-6，IL-6)、白细胞介素8(inerleukin-8，IL-8)等炎性反应因子的表达，从而产生生物学效应，介导炎性反应过程，参与肺损伤的发生、发展。MAPKs包括细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)、蛋白激酶p38和c-氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK) 3种通路蛋白。磷酸化的MAPKs(p-ERK1/2、p-p38、p-JNK)具有活性。前期的研究[3-6]表明，p38、JNK活性蛋白通路在碳酰氯吸入性肺损伤中发挥作用，本研究旨在探讨MAPKs与NF-κB在碳酰氯吸入性肺损伤中的作用及相互关系。

1 资料与方法

1.1 主要试剂 固体碳酰氯(浙江省海宁中联化学有限公司)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF，上海生物工程有限公司)，ERK1/2特异性阻断剂PD98059、p38特异性阻断剂SB203580和JNK特异性阻断剂SP600125(上海碧云天公司)，大鼠NF-κB抗体(上海Santa cruz公司)，Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)，考马斯亮蓝试剂盒(上海钰森生物技术有限公司)。

1.2 动物分组及给药 40只雄性Wistar大鼠，体质量220～280 g，第二军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(沪)2007-0003，适应性饲养1周。将40只大鼠随机分为空气对照组、碳酰氯吸入组、PD98059干预组、SB203580干预组和SP600125干预组，每组8只。空气对照组吸入空气，碳酰氯吸入组与3个干预组吸入相同浓度的碳酰氯。3个干预组在暴露于碳酰氯前30 min时给予相应的特异性阻断剂，PD98059(0.4 mg/100 g)腹腔内注射，SB203580(25 μg/100 g)静脉注射，SP600125(30 μg/100 g)皮下注射。空气对照组和碳酰氯吸入组给予等量0.9%氯化钠液，药物配制及用药剂量参照文献[6]。

1.3 碳酰氯吸入性肺损伤模型的制备及标本的采集 大鼠实验前禁食24 h，自由饮水。应用德国拜耳健康医疗研究中心提供的定向流动碳酰氯吸入装置，制备大鼠碳酰氯吸入性肺损伤模型，给予8.33 mg/L的碳酰氯吸入(纯度为100%)，染毒时间5 min。大鼠腹腔内注射20%乌拉坦麻醉后，腹主动脉放血处死动物，肺动脉插管后即灌注0.5 mL含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)，以去除血管内容物和血浆，取部分肺组织分别行冰冻切片、甲醛固定，其余肺组织投入液氮快速冷冻后-80 ℃保存，以备后续检测。

1.4 检测项目

1.4.1 肺组织病理学检查 取右上叶肺组织，制备切片后HE染色，光镜下观察肺组织的病理变化。

1.4.2 肺组织中NF-κB p65蛋白表达的检测 采用免疫组织化学二步法，严格按照说明书操作，一抗(NF-κB抗体)稀释比例为1∶100，二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)稀释比例为1∶1000，二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)显色，苏木素轻度复染。在显微镜下观察，胞核和(或)胞浆呈现棕黄色的细胞为NF-κB阳性表达的细胞。

1.4.3 肺组织中NF-κB p65蛋白含量的检测 采用蛋白质印迹(Western blotting)法检测，用 Quantity one软件分析蛋白条带，内参照采用3-磷酸甘油脱氢酶(3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，蛋白含量采用目的条带校正容积/GAPDH校正容积表示。

2 结 果

2.1 肺组织的病理变化 光镜下观察发现，空气对照组肺组织结构完整，肺泡腔清晰，肺泡隔无水肿、炎性反应等改变；碳酰氯吸入组出现明显肺损伤，肺组织结构破坏，肺泡腔、血管旁和支气管周围有大量炎性细胞(包括巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞和中性粒细胞)浸润，肺泡间隔增厚，肺泡腔内有大量渗出物和透明膜形成，并可见肺间质出血和水肿。应用MAPKs特异拮抗剂预处理后，除PD98059干预组外，SB203580干预组、SP600125干预组的肺水肿明显减轻，肺泡腔渗出物及炎性细胞量减少，但其病理改变仍较空气对照组重，见图1。

2.2 肺组织中NF-κB p65蛋白表达的变化 免疫组织化学染色显示，空气对照组肺泡上皮细胞及气道上皮细胞见少量NF-κB阳性表达，碳酰氯吸入组NF-κB阳性细胞较多，广泛分布于肺内多种细胞中，包括肺泡上皮细胞、气道上皮细胞、胸膜间皮细胞、浸润炎细胞及间质纤维细胞，且细胞核内NF-κB表达增多；而SB203580干预组、SP600125干预组NF-κB阳性细胞明显减少，PD98059干预组NF-κB变化不明显，见图2。

A：空气对照组；B：碳酰氯吸入组；C：PD98059干预组；D：SB203580干预组；E：SP600125干预组

A：空气对照组；B：碳酰氯吸入组；C：PD98059干预组；D：SB203580干预组；E：SP600125干预组

2.3 肺组织NF-κB p65蛋白含量的变化 Western blotting结果显示，碳酰氯吸入组NF-κB p65蛋白的表达水平较空气对照组升高，差异有统计学意义(P<0.01)。SB203580干预组、SP600125干预组的NF-κB p65蛋白的表达水平均低于碳酰氯吸入组(P<0.05)。PD98059干预组NF-κB p65蛋白表达量与碳酰氯吸入组差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、表1。

1: 空气对照组；2：碳酰氯吸入组；3：PD98059干预组；4：SB203580干预组；5：SP600125干预组

表1 各组肺组织中NF-κB p65蛋白的相对表达量

3 讨 论

MAPKs是多种信息传递途径的交汇点和共同通路，在细胞分化、存活、死亡以及机体炎性反应中有重要作用。前期研究[5-6]表明，碳酰氯吸入所致的肺损伤过程中，MAPKs信号转导通路被激活；应用特异性阻断剂干预的实验证实，JNK、p38通路参与了肺损伤。

NF-κB是近年研究较多的一个促炎因子，其在炎性反应的发生及调节中起重要作用[7]。本研究免疫组织化学结果显示，碳酰氯吸入组肺组织中NF-κB蛋白表达明显高于空气对照组；而p38、JNK的特异性阻断剂SB203580、SP600125干预后NF-κB蛋白表达均低于碳酰氯吸入组，即NF-κB蛋白的表达增减趋势与p-JNK、p-p38一致；提示在碳酰氯吸入性肺损伤中，JNK和p38可通过调控NF-κB蛋白的表达而发挥作用。

本研究中HE染色结果显示，与空气对照组比较，碳酰氯吸入组肺损伤程度严重，而特异性阻断剂SP600125和SB203580干预后肺损伤明显好转；Western blotting结果显示，NF-κB蛋白表达水平变化与肺损伤的严重程度相关并受JNK和p38信号蛋白的调控。以上结果进一步证明，在碳酰氯吸入性肺损伤中，MAPKs的激活主要是通过p38、JNK信号通路的活化，调控NF-κB蛋白的表达，进一步调节炎性反应，这是碳酰氯吸入性肺损伤发病机制之一，与其他因素所致肺损伤的研究结果一致。

综上所述，碳酰氯吸入性肺损伤中，JNK、p38通路可通过调控NF-κB的表达而调节炎性反应，而NF-κB对JNK、p38通路是否存在反馈调节作用，有待进一步研究。

[1]Mukhopadhyay S,Mukherjee S,Smith M,et al.Activation of MAPK/AP-1 signaling pathway in lung injury induced by 2-chloroethyl ethyl sulfide,a mustard gas analog[J].Toxicol Lett,2008,181(2):112-117.

[2]王月兰,姚尚龙.丝裂原蛋白激酶信号转导通路在机械通气相关性肺损伤中的作用[J].中华实验外科杂志,2006,23(3):331-333.

[3]Shen J,Wang J,Shao YR,et al.Adenovirus-delivered angiopoietin-1 treatment for phosgene-induced acute lung injury[J].Inhal Toxicol,2013,25(5):272-279.

[4]He DK,Shao YR,Zhang L,et al.Adenovirus-delivered angiopoietin 1 suppresses NF-κB and p38 MAPK and attenuates inflammatory responses in phosgene-induced acute lung injury[J].Inhal Toxicol,2014,26(3):185-192.

[5]邵义如,申捷,袁震,等.MAPKs信号通路在光气吸入性肺损伤中的表达及作用[J].中华劳动卫生职业病杂志,2012,30(4):278-283.

[6]邵义如,申捷,李卫,等.磷酸化丝裂原活化蛋白激酶在大鼠光气吸入性肺损伤中的作用及其与基质金属蛋白酶9的关系[J].中华烧伤杂志,2013,29(3):261-266.

[7]Tian Z,Li Y,Ji P,et al.Mesenchymal stem cells protects hyperoxia-induced lung injury in newborn rats via inhibiting receptor for advanced glycation end-products/nuclear factor κB signaling[J].Exp Biol Med (Maywood),2013,238(2):242-249.