三七总皂苷对博来霉素诱导的大鼠急性弥漫性肺泡损伤的保护作用

高风英 李玉霞 王星海 金文强 陈国平 刘振威

(1.上海市建工医院呼吸科,上海 200083；2. 上海交通大学附属第一人民医院呼吸科,上海 200080)

急性弥漫性肺泡损伤(acute diffuse alveolar damage,ADAD)是许多种严重肺损伤的最后结局，常见于急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合症(ALI/ARDS)、肺炎、脓毒症、肿瘤化疗药物引起的肺部疾病、吸入性肺损伤以及其他急性肺损伤患者。ADAD预后凶险，病死率高达72%,严重危胁患者的生命[1]。目前，治疗ADAD的措施多为对症支持治疗，效果欠佳[1]。近年研究[2]发现，三七总皂苷(total saponins of Panax notoginseng,PNS)可改善油酸诱导的急性肺损伤动物模型的呼吸力学特性，降低血管外的肺水含量，且正压机械通气与PNS有一定的协同作用。本研究建立了博来霉素诱导的大鼠ADAD模型, 多次给予PNS，然后检测大鼠动脉血浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平、肺组织中超氧化物歧化酶(SOD)和蛋白质的含量以及支气管肺泡灌洗液(BALF)中的中性粒细胞(PMN)和肺泡巨噬细胞(PAM)的数量，计算肺组织的含水率，并观察肺组织的形态变化,旨在评估PNS对ADAD的保护作用并分析其机制。

1 资料与方法

1.1 动物及分组 24只健康SD大鼠购自上海交通大学实验动物科学部，体质量(276.5±1.5) g , 雌雄各半。将24只大鼠随机分为A、B、C组,每组各8 只。A组为健康对照组，B组为模型组，C组为研究组。

1.2 试剂 人肿瘤坏死因子检测试剂盒(日本富士公司原装进口，批号：20110417)；人超氧化物歧化酶检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，批号：20110206)。

1.3 实验仪器 AU640型生化分析仪购自日本奥林巴斯公司；AXSYM型酶免分析仪购自美国雅培公司；ML780 型生理记录仪购自美国ADI公司；SF23000 型血球计数仪购自日本东亚公司；H27500型透射电镜购自日本东芝公司；DX5型光学显微镜购自日本奥林巴斯公司。

1.4 方法

1.4.1 应用博来霉素诱导大鼠ADAD模型的方法应用地西泮(2 mg/kg)联合氯胺酮(25 mg/kg)肌内注射麻醉大鼠，固定大鼠后行颈前正中切开，暴露气管，将头部抬高45°，在气管内一次性注入博来霉素溶液(5 mg/kg)。注药完毕后缝合切口，将大鼠直立、旋转，尽量使药液在肺内均匀分布。密切观察大鼠的呼吸情况，防止窒息。术后将大鼠置于干燥、温暖条件下喂养,定期消毒喂养场所。

1.4.2 各组大鼠的处理 A组静脉注射1.5 mL/kg的 0.9%氯化钠液。B组和C组均应用博来霉素诱导ADAD； 模型建立后，B组静脉注射0.9%氯化钠液，1.5 mL/(kg·d)，连续3d；C 组静脉注射PNS，100 mg/(kg·d)，连续3d。

1.5 实验指标

1.5.1 TNF-α的检测 干预结束后，3组大鼠各取1 mL股动脉血液，离心后分离血浆, 冷藏于-70 ℃，按肿瘤坏死因子检测试剂盒的说明书检测TNF-α的含量。

1.5.2 BALF 中蛋白质以及PMN和PAM的检测 干预结束后切取大鼠左肺, 用40 mL 0～4℃的0.9%氯化钠液分别灌洗肺和支气管5次，收集灌洗液；然后，采用瑞氏液染色计数法测定BALF中PAM和PMN的数量。以1500 r/min的转速将灌洗液离心5 min ,吸出上清液，采用考马斯亮兰法检测BALF中蛋白质的含量。

1.5.3 SOD的含量 严格按照测试盒的说明书检测大鼠肺组织匀浆液中SOD 含量。

1.5.4 肺组织的含水率的计算 肺组织的含水率=(湿质量-干质量)/湿质量×100% 。

1.5.5 肺的组织学形态 摘除大鼠的肺后，取少量肺部组织，在光镜下观察。

2 结 果

2.1 血浆中TNF-α水平的比较 见表1。

表1 3组大鼠血浆TNF-α水平的比较 ng/L

2.2 BALF 中细胞数量和蛋白质含量的变化情况

表2 3组BALF 中细胞数量和蛋白质含量的比较

由表2可知，B、C组BALF 中蛋白质含量明显高于A 组 (P<0.05)，C 组的PMN数量明显低于B组 (P<0.01)。说明PNS可以减轻博来霉素诱导的大鼠ADAD。

2.3 肺组织SOD含量、含水率的比较 见表3。

表3 3组肺组织中SOD 的含量与含水率比较

2.4 肺组织形态学观察 肺组织切片经HE染色后在光学显微镜下观察大鼠肺泡壁情况，A 组相邻的肺泡仅间隔薄层的间质；B 组肺泡间质变厚,有粒细胞浸润,部分肺组织不张；C 组肺泡的间质变厚，但粒细胞浸润的程度明显轻于B组。 见图1。

图1 大鼠肺组织形态学观察(HE染色，×10)

3 讨 论

ADAD 后期可引起肺间质纤维化和支气管周围纤维化，病情严重者可因肺间质纤维化进展以及肺实质的广泛破坏而形成蜂窝肺，导致肺功能发生严重且不可逆的损害[1]。

有研究[3]显示，体内TNF-α水平升高会加剧ADAD，且TNF-α水平升高的程度与ARDS 的发生有关；抗TNF-α抗体能减轻肺组织的损伤程度，且可有效减少感染和炎性反应[4]。本研究显示，博来霉素诱导建立SD大鼠ADAD模型后，血浆中TNF-α水平较诱导前升高；给予PNS能抑制血浆TNF-α水平升高的程度,说明PNS可能通过干扰TNF-α的合成和释放而发挥其对肺组织损伤的保护作用。但是，PNS的作用机制目前尚未明确，有待进一步研究。

有研究[4]指出,PMN在在肺泡腔内大量积聚是引起ADAD特征性改变的原因。通过对BALF中PMN总数进行检测，可了解PMN浸润的程度；对BALF中的蛋白质和含水量的测定可反映肺血管内皮细胞损伤的程度。本研究显示，干预后B组和C 组BALF 中蛋白质含量、PMN总数和含水率均高于A 组，但C组上述指标的变化幅度明显小于B组，说明PNS可明显改善博来霉素引起的肺组织水肿等ADAD表现。

此外，本研究中B 组SOD 的活性低于A 组，而C 组中肺组织的SOD活性高于B 组，说明PNS能增强SOD 的活性。这提示对于ADAD,及早应用PNS有利于清除体内的氧自由基,减少受损细胞的数量,从而保护肺组织。

综上所述，PNS可以降低血浆中TNF-α水平，减轻PMN浸润和肺水肿程度，清除体内氧自由基，有效地保护肺组织，这对于抢救ADAD患者具有重要意义。

[1]Sakamoto K, Taniguchi H, Kondoh Y, et al. Acute exacerbation of idiopathic pulmonary fibrosis as the initial presentation of the disease[J]. Eur Respir Rev,2009,18(112):129-132.

[2]张剑锋，张丹参.三七总皂甙药理作用研究进展[J]. 医学综述,2007,13(6):472-474.

[3]Bhargava R, Altmann CJ, Andres-Hernando A, et al. Acute Lung Injury and Acute Kidney Injury Are Established by Four Hours in Experimental Sepsis and Are Improved with Pre, but Not Post, Sepsis Administration of TNF-α Antibodies[J]. PLoS One, 2013,8(11):e79037.

[4]Bhargava M, Wendt CH. Biomarkers in acute lung injury[J]. Transl Res,2012,159(4):205-217.