黄芪提取液发酵枯草芽孢杆菌工艺优化研究

乔宏兴，史洪涛，张帅帅，边传周*

(1.河南牧业经济学院 生物工程系，河南 郑州 450046；2.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002)

黄芪提取液发酵枯草芽孢杆菌工艺优化研究

乔宏兴1，史洪涛2，张帅帅1，边传周1*

(1.河南牧业经济学院 生物工程系，河南 郑州 450046；2.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002)

为研究黄芪提取液发酵枯草芽孢杆菌的工艺流程，将活化后的枯草芽孢杆菌菌液以1%的比例分别接入含黄芪提取液浓度为100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%的液体培养基中，置于37 ℃温箱中进行培养，分别取24 h、48 h、72 h的培养物检测菌液数量、芽孢形成率和OD值。对初筛的培养基配方选取接种量、pH、温度和摇床转速4个条件进行正交试验观察影响发酵的主要因素并进行发酵罐大量培养。结果表明：含60%黄芪提取液芽孢数量最高可达1.70×109，芽孢形成率99%，OD值为2.961。正交试验结果优化条件为接种量10%，pH9.0，温度37 ℃，转速250 r/min，发酵罐培养结果48 h即可发酵结束，芽孢数量比摇瓶培养高5倍左右。

黄芪；枯草芽孢杆菌；发酵

枯草芽孢杆菌是饲料中常用的一种添加剂，具有维持肠道菌群平衡、调节机体免疫功能、提高生产性能等作用[1]。黄芪是常用的一种中草药，味甘、性温，有补气升阳、固表止汗、脱毒排脓和生肌等功效[2-3]，其有效成分黄芪多糖已被证实具有提高动物生产性能，增强机体免疫力等作用[3]。传统的合生元是简单的将益生菌与植物多糖组合在一起，虽然在临床中也起到了一定的作用，但是并没有充分发挥出微生物发酵的巨大潜力。黄芪多糖具有发酵益生菌的作用，同时能提高中药活性成分含量、提高药效和降低毒副作用等优点[4-5]。目前研究大多采用黄芪多糖发酵益生菌，黄芪中的其他有效活性成分并未充分发挥作用，黄芪提取液对枯草芽孢杆菌发酵的研究报道较少。本研究以补益类中药黄芪提取液与枯草芽孢杆菌之间具有生物活性协同作用为依据，进行黄芪发酵枯草芽孢杆菌的生产工艺研究，(拟解决的关键问题)旨在通过优化发酵工艺，提高微生态制剂中芽孢的数量，为大规模生产降低生产成本，提高制剂的生防效果，为开展兽用中药的益生菌体外转化技术、中兽药的创新提供新技术和新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

本试验用黄芪购于郑州市晟昊大药房；枯草芽孢杆菌菌种由河南牧业经济学院生物工程系生物技术教研室保存；普通培养基按照常规方法进行配制[5]；20 L不锈钢发酵罐由镇江东方生物技术设备有限公司生产。

1.2 黄芪提取液制备

称取适量的洁净黄芪，分别加5倍量、3倍量、2倍量水煮沸三次，每次30 min，分别取留每次煮沸滤液，最后合并三次滤液为黄芪提取液。

1.3 菌种的活化

将枯草芽孢杆菌甘油冻存管菌种接入液体普通肉汤培养基中，37 ℃培养24 h，以1%的量接种于固体培养基中，置于37 ℃培养48 h后备用。

1.4 黄芪发酵培养基的筛选

以制备的黄芪提取液为主，添加适量液体普通肉汤、(NH4)2SO4、NaOH设计8种发酵培养基(由预试验得出)，分别命名为1～8号培养基，黄芪提取液:液体普通肉汤按(100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70)比例混合(V∶V)，另加入0.02 g (NH4)2SO4、0.04 g NaOH，各培养基调节pH为9.0。将培养的菌种以1%的量接种于8种发酵培养基中，37 ℃转摇培养72 h。

1.5 菌体浓度的测定

菌体浓度的测定使用比浊法进行测定，在培养过程中每隔12 h分别取样，用紫外-分光光度测定OD600nm值。

1.6 平板菌落计数法的测定

对1～8号培养基培养结束后，分别取发酵液1 mL，稀释至10-7、10-8、10-9倍(由预试验数据得出)，取0.1 mL的稀释液涂布于普通琼脂平板上(做两个重复)，37 ℃培养24 h，查出平板菌落数，根据公式：每毫升细菌数=平板上菌落数×稀释倍数/平板上加菌液的量(mL)来计算发酵液中细菌总量。

1.7 芽孢形成率的测定

对1～8号培养基培养结束后，按照参考文献[5]介绍的方法进行芽孢染色，染色后在显微镜下观察一个视野中100个细胞中芽孢的数量，芽孢的形成率=100%×(芽孢的数量/100)。

1.8 发酵条件的正交试验设计

以培养后枯草芽孢杆菌的数量为指标，选取接种量、pH值、温度和摇床转速4个条件进行正交试验，进行发酵条件的优化。采用L9(34)正交设计表，按表1所示的条件，接种枯草芽孢杆菌，发酵时间为72 h。对正交试验结果进行极差分析，分析四个因素中主要影响发酵质量的关键因素。

表1 正交设计因素表Table 1 The factor table of the orthogonal design

1.9 发酵灌培养工艺优化

用20 L发酵罐发酵培养菌液15 L，先清洗发酵罐，空罐进行消毒(121 ℃，30 min)，将发酵培养基(黄芪60%，液体普通肉汤30%、玉米粉10%，(NH4)2SO40.02%、NaOH 0.04%)装入灌中，加入消沫剂，调节初始pH为9.0，然后进行培养基的高压灭菌，同样为121 ℃ 30 min，接种培养24 h的液体菌种，调节温度、转速，进行枯草芽孢杆菌的发酵培养，每隔6 h进行取样检测发酵液菌体含量和pH的变化，观察枯草芽孢杆菌发酵过程的动态变化。

2 结果与分析

2.1 黄芪发酵培养基对菌种生长的影响

用1～8号培养基进行枯草芽孢杆菌的培养，分别取24 h、48 h、72 h的培养物进行芽孢率、菌体浓度和芽孢菌总量的测定。

由表2知，黄芪提取液在发酵培养基中为60%的时候，菌体的总量是最多的，可以达到1.70×109，培养基全是黄芪提取液的时候，芽孢菌不会生长，可能是黄芪提取液中的一些物质会抑制芽孢菌的生长，随着黄芪提取液含量的下降，芽孢菌体数量会增多，但在添加含量低于60%以后，菌体的总量又会开始下降。在芽孢形成率方面，一般在24 h即可生成90%左右，到48 h基本可以全部生成芽孢，而72 h与48 h在形成芽孢率方面无有多大区别。

2.2 发酵条件优化正交试验验证

正交试验结果见表3。 由表3可知，采用相同培养基，9个组合中第4个组合的活菌数最高，为9.8325 Log cfu/mL(Log 106.8×109cfu/mL)，组合3的活菌数最低7.8388 Log cfu/mL(Log 106.9×107cfu/mL)，最高活菌数的倍数是最低活菌数的1.25倍。其他组合条件下的活菌数为7.8976 Log cfu/mL(Log 107.9×107cfu/mL)～9.7709 Log cfu/mL(Log 105.9×107cfu/mL)，由此确定第四个组合：即接种量10%，pH9.0，温度37℃，转速250 r/min为正交试验筛选出的最优组合。由极差R值可以看出，极差越大说明对活菌数量的产生影响越大，在四个条件中，pH的极差最大为5.6635，说明pH的大小是影响活菌数的主要因素。温度的极差最小为0.0507，说明在三个温度条件中，温度的差别对活菌数的产生影响最小。

2.3 枯草芽孢杆菌的发酵培养

发酵罐培养枯草芽孢杆菌发酵过程菌体数量和pH的动态变化结果见图1和图2。

由图1知，摇瓶培养与发酵罐培养稳定期其菌数可相差5倍左右，而且从发酵罐培养来看，发酵后24 h就进入对数生长期，36 h就可进入稳定期，而摇瓶培养，其生长培养没有很明显的对数生长期，其菌数增长缓慢，72 h才能达到1.70×109个/mL,发酵罐培养枯草芽孢杆菌的生长更快，发酵时间可缩短为48 h即可，大大提高了发酵速度和效果。由图2知，发酵液的pH从最初的9.0开始下降，到18 h后下降为6.5并一直稳定到后期。

表2 黄芪发酵培养基的筛选结果Table 2 Results of preparation of Astragalus fermentation medium

表3 L9(34)正交试验方案与结果Table 3 The scheme and result of the orthogonal test L9(34)

3 讨 论

3.1 发酵培养基对枯草芽孢杆菌生长的影响

本试验以黄芪提取液不同的添加比例于普通培养基中进行枯草芽孢杆菌的培养，结果证明添加60%的黄芪提取液时芽孢菌的数量最高，使用黄芪提取液全培养物则不能生长，说明黄芪提取液不能提供给芽孢菌生长所需要的碳源、氮源，也可能是黄芪提取液中的某些有效成分浓度较高的时候会抑制芽孢菌的生长。本试验选取高浓度的黄芪提取液，并未选取低浓度的黄芪，主要是因为一些研究证实低浓度的黄芪多糖能有效提高芽孢菌的数量，高浓度的黄芪多糖能抑制芽孢菌的生长[9-10]，本试验的结果证实与一些研究成果有所不同，黄芪提取液只有在浓度特别高的时候抑制芽孢菌的生长，当浓度下降的时候则有利于芽孢菌的生长，试验结果的不同可能与所用的菌株不同有关，具体机理和作用机制有待于进一步研究。在本试验中，芽孢菌的芽孢形成率可达到90%以上，而且24 h之后即可生成芽孢，这对于大规模的生产和进行商品芽孢制剂的开发非常有用。

图1 枯草芽孢杆菌发酵菌体数量动态变化 Fig.1 Development of thalli quantity for Bacillus subtilis

图2 枯草芽孢杆菌发酵pH动态变化Fig.2 Development of pH for Bacillus subtilis

3.2 发酵条件优化正交试验

发酵是指微生物细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物，以有机物为最终电子受体的生物氧化过程，是部分厌氧微生物和兼性厌氧微生物在无氧环境中获得能量的途径[11-13]。本试验中利用正交试验对枯草芽孢杆菌进行发酵条件的优化，确定枯草发酵最佳生长条件为接种量10%，pH9.0，温度37 ℃，转速250 r/min。与摇瓶培养时菌体的数量相比可增加10倍左右，这是因为摇瓶培养过程中，随着细菌数量的增加pH不断下降，发酵液中产生的糖被利用产生了酸性物质，pH值下降的缘故。在优化条件中也可以看出，对本株枯草芽孢杆菌影响作用较大的因素是pH，初始pH的大小对芽孢菌的数量产生影响比较大。

3.3 枯草芽孢杆菌的发酵培养

发酵培养基配方是影响微生物生长的一个重要因素，不同的细菌对营养的要求是不同的[14-15]，而工业化生产发酵还要考虑到生产成本的因素，对于培养基的选择应该遵循原料取材方便，来源广泛，价格低廉的原则，因此如何把农副产品作为芽孢菌的培养材料从而选择适合工业化生产的培养基配方是非常重要的，经过发酵培养试验证明，玉米粉农副产品应用于发酵罐培养既节约了生产成本，又增加了枯草芽孢杆菌的数量，芽孢形成的时间短而且形成率高，筛选出比较适合工业化生产的发酵培养基，为该菌实现工业化提供了基础，对于发酵培养基的体系仍需进一步完善。

4 结 论

黄芪提取液在发酵培养基中为60%时，菌体总量最多，可达到1.70×109，芽孢形成率90%左右。正交试验结果表明接种量10%，pH9.0，温度37 ℃，转速250 r/min为筛选出的最优组合。摇瓶培养与发酵罐培养其菌数可相差5倍左右，发酵罐培养枯草芽孢杆菌生长更快，发酵时间可缩短为48 h，大大提高发酵速度和效果。发酵液pH值从最初9.0开始下降，到18 h后下降为6.5并一直稳定到后期。根据本研究结果为枯草芽孢杆菌的工业化生产提供试验数据。

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《家畜生态学报》入选中文核心期刊

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ResearchOnOptimizingAstragalusExtractionLiquidFermentationTechnologyofBacillussubtilis

QIAO Hong-xing1，SHI Hong-tao2，ZHANG Shuai-shuai1，BIAN Chuan-zhou1*
(1.DepartmentofBioengineering,HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy,ZhengzhouHenan450011,China;2.CollegeofAnimalHusbandryandVeterinary,HenanAgriculturalUniversity，ZhengzhouHenan450002,China)

This experiment was to research Astragalus extraction liquid fermentation technology ofBacillussubtilis.Bacillussubtilisactivated with a ratio of 1% was connected with Astragalus extract with concentrations of 100%,90%,80%,70%,60%,50%,40%,30% in liquid medium at 37 ℃for culturing respectively.After 24 h,48 h,72 h,the bacteria liquid quantity,spore forming rate and OD value were detected.Under the four factors of inoculation amount,pH value,temperature and shaking speed,the culture medium screened was taken to do the orthogonal experiment to observe the main element affecting the fermentation,and then fermenting in large scale in the fermentation tank.The results showed that: 60% Astragalus extract contained up to 1.70×109spores,with a spore forming rate of 99%,OD value being 2.961.The results of orthogonal test revealed the optimal conditions being 10% inoculation quantity,ed pH 9.0,temperature 37 ℃,and speed 250 r/min.The results for culturing in fermentation tank showed that the fermentation terminates at 48 h,with the amount of spores 5 times more than that of shaking flask culture.This study provides the experimental data for industrial production ofBacillussubtilis.

astragalus;Bacillussubtilis; fermentation

2014-02-28，

2014-03-24

河南省科技攻关项目(142102310034)；河南省科技成果转化项目(142201110029)

乔宏兴(1976-)，男，河南长垣人，硕士，副教授，研究方向：动物营养免疫学。E-mail:zzmzqhx@163.com

*[通讯作者]边传周(1966-),男，河南商丘人，教授，硕士，研究方向：动物营养免疫学。E-mail:chuanzhou-bian@126.com

S811.6

A

1005-5228(2014)07-0058-05