肾盂输尿管连接部梗阻段Cajal间质细胞和CX43表达的检测

李 浩，范应中#，孙生安，李泸平，张胜利，王文举, 杜昆峰

1)郑州大学第一附属医院小儿外科 郑州 450052 2)洛阳市中心医院普外科 洛阳 471000

肾盂输尿管连接部梗阻段Cajal间质细胞和CX43表达的检测

李 浩1)，范应中1)#，孙生安2)，李泸平1)，张胜利1)，王文举1), 杜昆峰1)

1)郑州大学第一附属医院小儿外科 郑州 450052 2)洛阳市中心医院普外科 洛阳 471000

#通讯作者，男，1965年3月生，博士，主任医师，研究方向：尿道组织工程，E-mail：fanyingzhong2@163.com

先天性肾积水；Cajal间质细胞；CX43；C-kit

先天性肾盂输尿管连接部梗阻(ureteropelvic junction obstruction，UPJO)是小儿泌尿外科最常见的先天畸形之一[1]，其所致肾积水的发病率为1/800～1/600[2]。有研究[2]提示UPJO的病因可能与Cajal间质细胞密切相关。Cajal间质细胞是1893年由神经解剖学家Santiago Ramon Y Cajal在胃肠道神经系统首次发现并以其名字命名的，它是存在于胃肠道自主神经末梢和平滑肌之间的一种特殊间质细胞，主要位于非胆碱非肾上腺素能神经纤维末梢和平滑肌之间。该研究通过HE染色、C-kit和缝隙连接蛋白43(connexin 43,CX43)免疫组织化学染色，了解Cajal间质细胞和CX43在肾盂输尿管连接处的分布情况，探讨它们在先天性肾积水发病中的作用及其临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2011年7月至2013年6月在郑州大学第一附属医院小儿外科住院、因先天性肾积水行单侧肾盂成形术的患者的UPJO段组织样本35例(病例组)；35例中男21例，女14例，年龄35 d～14岁[(4.5±4.0)岁]，左侧18例，右侧17例。所有患儿术前经泌尿系彩超、静脉肾盂造影或CT尿路造影、逆行膀胱造影等确诊为UPJO引起的肾积水，术中均证实为肾盂输尿管连接部狭窄。依据肾盂积水程度分级标准[3]分为轻度肾积水10例，中度肾积水11例，重度肾积水14例。取20例因肾脏肿瘤行肾切除患者的肾盂输尿管连接处组织作对照，排除肾盂输尿管连接处狭窄，组织学证实无侵犯；20例中男11例，女9例，年龄3个月～6岁[(3.3±1.7)岁]，左侧8例，右侧12例。

1.2 2种组织组织学观察和CX43、C-kit蛋白的检测

实验试剂：鼠抗人C-kit单克隆抗体(Sc-5655,美国Santa Cruz公司)，兔抗人CX43多克隆抗体(MY90198,上海翔升生物科技有限公司)，SP-9000免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒、聚赖氨酸(北京中杉金桥生物技术有限公司)，中性树脂(上海标本模型厂)。

标本制备和检测方法：将待检标本浸泡在体积分数10%的甲醛溶液中固定24 h以上，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后行连续性切片，厚度3～4 μm，之后将切片分别置于APES胶处理过的载玻片上，室温干燥48 h后置入4 ℃冰箱内保存，分别用于HE染色、C-kit与CX43免疫组化染色，染色步骤均按试剂盒说明操作。抗体按1100稀释。C-kit结果判定：每张切片观察5个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞，胞浆内可见棕色颗粒状物质者为C-kit阳性细胞。分级标准[4]：视野中未见阳性细胞为(-)；偶尔可见阳性细胞或判断不明确为(+)；可见阳性细胞，但阳性细胞百分比小于10%为()；阳性细胞百分比大于10%者为()。、视为C-kit蛋白表达阳性。CX43结果判定：每张切片观察5个高倍镜视野，CX43免疫反应物呈黄褐色颗粒状，主要分布于相邻两细胞膜接触处及其两侧的细胞浆内。分级标准[5]：视野中看不到阳性染色细胞区域的为(-)；可看到1处阳性染色区域但未见明显棕黄色颗粒状物质或者是判断不清的为(+)；可看到2～3处阳性染色区域或者可见明显的棕黄色颗粒状染色区域的为()；可看到多于4处阳性染色区域或者看到棕黄色颗粒状呈小团块状的染色组织为()。、视为CX43蛋白表达阳性。

1.3统计学处理采用SPSS 17.0处理数据。采用χ2检验比较2组C-kit和CX43蛋白阳性表达率的差异，病例组C-kit蛋白阳性表达率与肾积水程度的相关性采用Spearman相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组C-kit及CX43表达的比较组织学观察结果显示，对照组标本平滑肌内纵外横排列规则，未见明显纤维组织增生。病例组标本可见输尿管平滑肌肌层肥厚，排列紊乱，细胞胞浆嗜酸性减弱，细胞间质纤维组织少量增生，同时黏膜层可见不同程度的炎性细胞浸润。免疫组化染色结果显示对照组标本肌间可见较多C-kit阳性细胞，细胞体积较大，呈梭形或星形，细胞核大，核周胞质较少；浆膜及黏膜层未见C-kit阳性细胞。病例组标本肌间未见或可见少量C-kit阳性细胞。对照组标本环形肌和纵形肌交界处可见CX43阳性表达，部分沿血管壁分布，黏膜下层亦可见阳性表达。病例组肌层偶见CX43阳性表达，大部分标本未见CX43的阳性表达。见图1。2组C-kit和CX43蛋白阳性表达率的比较见表1。

图1 HE染色及免疫组化染色结果

A1：对照组输尿管平滑肌排列规则(HE, ×200)；A2:病例组输尿管肌层肥厚，排列紊乱(HE，×200)；B1：对照组输尿管肌层可见较多C-kit阳性细胞(SP，×400)；B2：病例组输尿管肌层C-kit阳性细胞明显减少(SP，×400); C1:对照组输尿管肌层分布较多CX43蛋白(SP，×400)；C2：病例组输尿管肌层CX43蛋白分布明显减少(SP，×400)。

表1 2组C-kit及CX43蛋白阳性表达率比较 例(%)

2.2病例组C-kit蛋白的表达与肾积水程度的关系病例组C-kit蛋白的表达随肾积水程度的加重呈下降趋势。见表2。

表2 病例组C-kit蛋白的表达与肾积水程度的关系 例

rs=-0.486，P=0.003。

3 讨论

近年来很多学者在输尿管平滑肌运动和神经分布及支配方面做了大量的实验研究，但仍未能完全揭示UPJO的病理机制。有研究[6-7]证实Cajal间质细胞是慢波电位的起搏者和基本电节律的传播者。先天性UPJO平滑肌肌间Cajal间质细胞比正常组织减少[8]。相关研究[9]发现，Cajal间质细胞与平滑肌细胞、神经细胞之间可形成网络和许多缝隙连接，在控制平滑肌的蠕动和介导神经信息传导中发挥重要作用。CX43作为人体中一种重要的缝隙连接蛋白，参与机体的许多病理生理过程，其分布或者表达异常与多种疾病有密切关系，如不稳定性膀胱和膀胱输尿管返流等[10]。

多项研究[11-12]显示输尿管组织内存在多种类型的神经组织，而且这些神经组织可能在输尿管的蠕动中起关键作用。作者通过C-kit标记Cajal间质细胞，免疫组化染色结果表明，与对照组相比，病例组Cajal间质细胞减少，CX43蛋白阳性表达率降低。UPJO中肾盂输尿管连接处肌层间Cajal间质细胞减少可使起搏细胞慢波电位的产生减少，该处的电活动不能有效向下传导，平滑肌的收缩节律不规整，从而引起输尿管蠕动减弱，尿液流出受阻，导致梗阻性肾积水。此外，该研究结果还显示，随着肾积水程度的加重，C-kit蛋白的表达呈减少趋势，表明Cajal间质细胞的减少可能与肾积水的病理进程存在一定关系。

综上所述，Cajal间质细胞及CX43蛋白的表达减少可能在先天性梗阻性肾积水的发病中发挥较为重要的作用，但其表达减少是引起UPJO的始动因素，还是梗阻之后出现的继发性改变，尚有待于进一步研究。

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(2013-06-21 收稿 责任编辑 徐春燕)

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.036