褪黑素对大鼠脊髓损伤后肿瘤坏死因子-α表达的影响*

徐玉生，张 松，金伟林，李星晨，崔 浩,王培松，文建国

1)郑州大学第一附属医院骨科 郑州450052 2)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052

褪黑素对大鼠脊髓损伤后肿瘤坏死因子-α表达的影响*

徐玉生1)△，张 松1)，金伟林1)，李星晨1)，崔 浩1),王培松1)，文建国2)

1)郑州大学第一附属医院骨科 郑州450052 2)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052

△男，1969年3月生，博士，副教授，副主任医师，研究方向：骨科疾病的基础与临床， E-mail: ysxu@zzu.edu.cn

脊髓损伤；褪黑素；肿瘤坏死因子-α；大鼠

目的：探讨褪黑素(MT)对脊髓损伤(SCI)大鼠体内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响及可能机制。方法108只SD大鼠随机分为3组。假手术(Sham)组仅行椎板切除不损伤脊髓，SCI组与SCI+MT组采用改良的Allen’s法建立SCI模型；SCI+MT组术后10 min腹腔注射MT(100 mg/kg)，SCI组注射等量体积分数5%乙醇。术后12 h各组选6只取脊髓，采用HE染色法和免疫组化法分别观察脊髓组织的病理变化和TNF-α蛋白的表达情况。术后1、12、24、48、72 h，各组分别取6只大鼠，用ELISA法检测血清TNF-α水平，RT-PCR法测定脊髓组织 TNF-α mRNA的表达。结果SCI+MT组病理改变较SCI组明显减轻。脊髓组织中TNF-α蛋白主要分布在神经元和胶质细胞的胞浆和胞核；3组TNF-α阳性细胞数差异有统计学意义(F=504.239，P<0.001)，其中SCI组最高，SCI+MT组次之，Sham组最低。各时间点3组血清TNF-α水平和脊髓组织中TNF-α mRNA的表达水平差异有统计学意义(P均<0.05)，其中SCI+MT组上述2指标低于SCI组，但仍高于Sham组(P<0.05)。结论MT可能通过抑制TNF-α的表达水平减轻损伤脊髓的继发性炎症损伤。

脊髓损伤(spinal cord injury, SCI) 包括原发性损伤及由原发性因素导致的继发性损伤。SCI后大量的炎性细胞浸润及大量炎症因子的产生是导致脊髓继发性损伤的主要因素。控制继发性损伤是SCI早期治疗的重要目标之一[1]。近年来, 肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在脊髓继发性损伤中的作用逐渐受到重视,被认为是众多炎症因子的始动因子，能上调其他炎症因子的产生, 在局部炎症级联反应中具有重要意义[2]。目前治疗SCI最常用的药物是甲基强的松龙，但大剂量的甲基强的松龙可引起一系列并发症，如感染、高血压、急性胃溃疡等。褪黑素(melatonin,MT)是一种由松果体分泌的神经内分泌激素，具有调节免疫、抗氧化、抗炎等多种生物学功能[3-4]。作者观察了MT对SCI后不同时期炎症因子TNF-α表达的影响，进一步明确MT对SCI后炎症反应影响的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物来源及分组SPF级健康成年雌性SD大鼠108只，体重(300±20) g，由河南省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(豫)2010-0002。 按随机数字表分为假手术(Sham)组、SCI+MT组、SCI组，每组36只。术前适应性喂养1周。

1.2主要试剂与仪器Trizol试剂、RT试剂盒、PCR试剂盒和Marker均购自北京全式金生物技术有限公司，引物购自北京博大泰克公司。大鼠TNF-α酶联免疫(ELISA)分析试剂盒购自美国RD公司。兔抗鼠TNF-α抗体、免疫组化试剂盒、DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。MT、焦碳酸二乙酯(DEPC)和溴化乙锭(EB)购自美国Sigma公司。PCR 扩增仪(美国Applied Biosystems公司，型号：2700)，低温离心机(美国Sigma公司，型号：3K30)，D-140图像记录分析系统(大连Jim-X Scientific，型号：D140)。

1.3动物模型的建立体积分数10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mg/kg), 必要时追加。麻醉生效后，俯卧固定于手术台上，术区备皮，以T12为中心，常规消毒、铺巾，背部正中切口，显露T11至T13，咬除该节段棘突及椎板，暴露相应脊髓段作为损伤区，于硬膜上方放置一长方形塑料垫片(0.4 mm×0.3 mm×0.1 mm)，再采用改良的Allen′s法[5]，将5 g砝码从高度10 cm处通过导管自由落下，对大鼠脊髓进行定量打击，建立大鼠急性SCI模型。局部见：打击处脊髓组织出现水肿、淤血但硬脊膜完整；整体见：大鼠出现摆尾反射，双下肢及躯体回缩扑动后，双后肢呈迟缓性瘫痪，表明撞击成功。随后用生理盐水冲洗伤口，逐层缝合肌肉、皮肤。MT按说明书要求，用无水乙醇进行稀释。术后10 min，SCI+MT组腹腔注射MT 100 mg/kg，SCI组给予等量含体积分数5%乙醇的生理盐水。Sham组仅咬除棘突及椎板，并未损伤脊髓。术后人工手法压迫帮助大鼠排尿(白天每4 h 1次)，直至相应时间点取材。

1.4 3组大鼠脊髓组织病理表现及TNF-α蛋白表达的检测术后12 h每组选取6只大鼠，腹腔注射麻醉后分别用生理盐水和40 g/L的多聚甲醛行升主动脉灌流固定，以损伤段为中心取约1.5 cm的脊髓组织，40 g/L多聚甲醛固定24 h后石蜡包埋、切片。HE染色观察脊髓的病理表现。每个标本取同序列切片5张，按照免疫组化试剂盒说明书要求进行TNF-α检测，以兔抗鼠TNF-α抗体(按200倍稀释)为一抗，以PBS代替一抗作阴性对照。细胞质及胞核染成黄褐色或黑色为阳性细胞，每张切片计数4个高倍镜视野中的阳性细胞数，取均值代表该张切片TNF-α蛋白的表达水平。

1.5 3组大鼠血清TNF-α水平及脊髓组织TNF-αmRNA表达的检测术后1、12、24、48及72 h，每组选取6只大鼠处死。每例样本取10 μL血清，采用ELISA法检测TNF-α，按试剂盒说明进行操作，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值，根据标准曲线计算样品中TNF-α的含量。取损伤段脊髓组织于液氮中保存。每例样本称取100 mg冻存的脊髓组织，研碎后加入1 mL Trizol试剂，提取总RNA，逆转录得cDNA。取2 mL cDNA按试剂盒说明进行目的基因扩增，以GAPDH为内参。TNF-α上游引物为5’-GAGTGACAAGCCTGTAGCC-3’，下游引物为5’-TTCCCTTCACAGAGCAAT-3’, 扩增产物大小为451 bp。GAPDH上游引物为5’-CGTATCGGACGCCTG GTT-3’，下游引物为5’-CGGAGATGATGACCCTTTT-3’，扩增产物大小为331 bp。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃总延伸6 min。取5 μL扩增产物与缓冲液混合后电泳，在紫外线投射仪下观察电泳条带，用D-140图像记录分析系统进行分析，以目的基因和内参条带灰度值的比值表示目的基因的表达水平。

1.6统计学处理采用 SPSS 17.0处理数据。采用单因素方差分析比较3组大鼠脊髓组织TNF-α阳性细胞数、血清TNF-α水平和脊髓组织中TNF-α mRNA表达水平的差异，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1术后一般情况Sham组较术前无明显变化，无神经系统损伤表现。术后早期，SCI组及SCI+MT组大鼠进食及活动明显减少，均出现不同程度的尿潴留情况，行走时后肢处于拖动状态；随着观察时间的延长，SCI+MT组大鼠活动及进食较SCI组有改善，但后肢运动功能未见明显改变。

2.2 3组大鼠脊髓组织病理表现和TNF-α蛋白的表达Sham组脊髓组织无充血水肿等变化。SCI组脊髓组织血管充血，细胞水肿，脊髓灰质中部分细胞核浓缩，染色增强，白质中炎性细胞浸润及少量红细胞渗出；TNF-α蛋白表达明显增加，主要存在于神经元和胶质细胞，散在分布在损伤区周围。SCI+MT组各个时间点病理改变均较SCI组轻，TNF-α蛋白的表达亦减少。见图1。TNF-α阳性细胞数由高到低依次为SCI组(13.8±0.5)、SCI+MT组(10.3±0.6)和Sham组(3.9±0.2)，3组间相比差异有统计学意义(F=504.239,P<0.001)，且组间两两比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。

图1 3组大鼠术后12 h时病理表现和TNF-α蛋白的表达

2.3 3组大鼠血清TNF-α水平的比较SCI组和SCI+MT组血清TNF-α水平在术后12 h达高峰。术后各时间点，SCI+MT组血清TNF-α水平低于SCI组，但仍高于Sham组。见表1。

表1 3组大鼠不同时间点血清TNF-α水平(n=6)

*:与Sham组比较,P<0.001;#:与SCI组比较,P<0.001。

2.4 3组大鼠脊髓组织中TNF-αmRNA表达水平的比较SCI组和SCI+MT组脊髓组织中TNF-α mRNA的表达水平在术后12 h达高峰。术后各时间点，SCI+MT组脊髓组织中TNF-α mRNA的表达水平低于SCI组，但仍高于Sham组。见图2、3，表2。

图2 SCI+MT组脊髓组织TNF-α mRNA的表达

图3 3组大鼠术后12 h脊髓组织TNF-α mRNA的表达

表2 3组大鼠不同时间点脊髓组织TNF-αmRNA检测结果(n=6)

组别1h12h24h48h72hSham组0．102±0．0050．110±0．0070．104±0．0060．102±0．0100．101±0．006SCI组0．407±0．011∗0．841±0．035∗0．688±0．028∗0．329±0．009∗0．190±0．007∗SCI+MT组0．269±0．007∗#0．518±0．013∗#0．414±0．019∗#0．201±0．012∗#0．123±0．008∗#F1944．0001639．0001244．000615．938224．640P<0．001<0．001<0．001<0．001<0．001

*:与Sham组比较，P<0.001;#:与SCI组比较，P<0.001。

3 讨论

急性SCI后可引发一系列的炎症反应等病理生理过程, 导致继发性损伤。阻断继发性损伤是SCI早期治疗最重要的目标之一。

TNF-α是具有多种生物活性的炎性细胞因子, 在炎症反应及免疫调节等方面起重要作用。有研究[6-8]表明SCI后血中TNF-α持续高表达且是最早升高的细胞因子，可上调其他细胞因子的产生，参与了脊髓继发性损伤的过程。TNF-α能诱导花生四烯酸、脂质过氧化物及氧自由基的产生，上述物质能损伤细胞膜并能增加血管的通透性，这些特性可能与SCI后水肿形成的机制有关[9]。该实验结果显示，SCI后12 h，损伤脊髓组织血管充血，细胞水肿，组织内TNF-α表达明显增加，且主要表达于神经元和胶质细胞，弥散分布在损伤区周围；血清TNF-α水平和脊髓组织TNF-α mRNA表达水平达高峰；说明TNF-α可能参与了脊髓继发性损伤过程。因此控制TNF-α的高表达对减轻脊髓继发性损伤有重要意义。

MT具有高度的脂溶性和水溶性，能透过核膜进入核内发挥作用，因此不仅能保护膜脂质，还能保护蛋白质、核酸及细胞其他成分[10]。作者的前期实验[11]结果显示MT能够提高损伤脊髓抗炎因子IL-10的表达水平，达到保护损伤脊髓的作用。也有文献[12-13]证实MT有镇痛作用，并能直接清除自由基，抑制髓过氧化物酶，减轻中性粒细胞介导的毒性损害，具有一定的抗炎作用。相关研究[14]证实MT在肺的烟雾吸入性损伤模型中能够抑制TNF-α的表达。该研究结果显示SCI组术后血清TNF-α表达水平较Sham组明显升高，说明由于术后血脊髓屏障的破坏，来源于血液中高浓度的TNF-α可能参与了脊髓的继发性损伤。SCI+MT组各时间点血清TNF-α含量及脊髓组织TNF-α mRNA的表达均低于SCI组，脊髓组织TNF-α蛋白的表达明显减少，局部组织炎症反应减轻。以上结果证明MT能降低SCI后TNF-α的表达水平，从而减轻SCI后的炎症反应，对损伤脊髓有保护作用。

MT对SCI保护性治疗作用的研究还处于初级阶段。作者在前期实验[11]探讨了MT对抗炎因子的促进作用，而该实验结果显示MT能抑制促炎因子TNF-α的表达，进一步证明了MT对SCI大鼠有保护作用,对SCI的科研及临床治疗有重要的参考意义。该实验仅初步探讨了MT对SCI后TNF-α表达的影响，仍有不足之处，如只观察了MT对单一炎症因子表达的影响，其中的具体机制尚需要进一步实验研究。

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(2013-08-22 收稿 责任编辑 徐春燕)

Effects of melatonin on expression of TNF-α in rats with acute spinal cord injury

XUYusheng1),ZHANGSong1),JINWeilin1),LIXingchen1),CUIHao1),WANGPeisong1),WENJianguo2)

1)DepartmentofOrthopedics,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

2)InstituteofClinicalMedicineofHenanProvince,Zhengzhou450052

spinal cord injury; melatonin; tumor necrosis factor-α;rat

Aim: To investigate the effects of melatonin(MT) on the expression of tumor necrosis factor-α(TNF-α) in acute spinal cord injury(SCI) rats. Methods:A total of 108 SD rats were randomly allocated into three groups:Sham group only accepted laminectomy without SCI， and SCI group and SCI+MT group used the modified Allen's method to establish SCI model. 100 mg/kg MT was given to the rats in SCI+MT group, and 5% ethanol, to SCI group at 10 min after the model establishment．At 12 h, spinal cord samples of 6 rats from each group were prepared for histological examination using HE and immunohistochemical SP staining to detect the expression of TNF-α. At 1,12,24,48 and 72 h, 6 rats in each group were executed,the serum level of TNF-α was determined by ELISA, and the expression of TNF-α mRNA was detected by RT-PCR.Results: Compared with SCI group,the pathological changes in SCI+MT group were significantly alleviated.Immunohistochemical staining showed that TNF-α protein in spinal cord tissue mainly located in the cytoplasm and nucleus of neurons and glial cells;SCI group was the highest，SCI+MT group followed, and Sham group was the lowest(F=504.239，P<0.001). At different time points, the serum level of TNF-α and the expression of TNF-α in spinal cord tissue in SCI+MT group were significantly lower than those in SCI group, but still higher than those in Sham group(P<0.05). Conclusion: MT may reduce secondary injury of SCI by inhibiting the expression of TNF-α.

*郑州市科技攻关计划项目 2010S0828

R681.5+4

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.012