葡萄籽原花青素对慢性间歇性低氧大鼠脑组织炎症反应及学习记忆能力的影响*

赵雅宁，曹书华，郭 霞，王红阳

1)天津中医药大学 天津 300000 2)河北联合大学康复医学院 唐山063000 3)天津市第一中心医院急救医学研究所 天津 300000

葡萄籽原花青素对慢性间歇性低氧大鼠脑组织炎症反应及学习记忆能力的影响*

赵雅宁1，2)，曹书华3)#，郭 霞2)，王红阳2)

1)天津中医药大学 天津 300000 2)河北联合大学康复医学院 唐山063000 3)天津市第一中心医院急救医学研究所 天津 300000

#通讯作者，男，1945年10月生，主任医师，教授，研究方向：重症医学，E-mail：zyning789@126.com

间歇性低氧；p38MAPK；IL-1β；学习记忆能力；葡萄籽原花青素；大鼠

目的：探讨葡萄籽原花青素对慢性间歇性低氧大鼠脑组织炎症反应及学习记忆能力的影响。方法56只雄性SD大鼠随机分成对照组、模型组和葡萄籽原花青素高、低剂量干预组。对照组暴露于空气中，余3组制备慢性间歇性低氧模型(低氧处理6周)。葡萄籽原花青素高和低剂量干预组在低氧处理前2周开始每天1次灌胃葡萄籽原花青素200和100 mg·kg-1。低氧处理第2和6周，采用水迷宫实验测试大鼠学习记忆能力，电镜观察海马区神经细胞超微结构，免疫印迹法检测海马区脑组织磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)和IL-1β的表达。结果与对照组比较，模型组神经细胞超微结构受损严重，脑组织p-p38MAPK 和IL-1β表达升高，水迷宫实验逃避潜伏期延长、穿台次数减少(P<0.05)。与模型组比较，葡萄籽原花青素干预组神经细胞超微结构的损伤减轻，脑组织p-p38MAPK和IL-1β表达水平降低，水迷宫实验逃避潜伏期缩短、穿台次数增多(P<0.05)；高剂量干预组变化更为显著(P<0.05)。结论葡萄籽原花青素可能通过减轻脑组织炎症反应，改善慢性间歇性低氧大鼠的学习记忆能力。

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep aplnea-hypopnea syndrome, OSAHS)可造成患者警觉、执行能力和运动协调方面的认知障碍[1-2]。OSAHS神经损伤机制复杂。临床资料[3]显示OSAHS患者体内存在明显的炎症反应增强，而炎症反应在缺血缺氧性脑损伤的发生发展中发挥重要作用，且与认知障碍的形成密切相关。原花青素是天然植物中广泛存在的一大类多酚类化合物的总称，属于植物多酚类物质，以葡萄籽中含量最为丰富。研究[4-7]表明葡萄籽原花青素具有抗氧化、清除自由基、保护心血管、降血脂、抗肿瘤等功能。作者采用浓度结合时间切换的方式建立慢性间歇性缺氧大鼠模型，模拟临床睡眠呼吸暂停的低氧状态，探讨葡萄籽原花青素对低氧大鼠脑组织磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)和IL-1β蛋白表达及学习记忆能力的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料雄性SD大鼠56只购于北京维通利华公司，合格证SCXK(京)2002-003，体重310～350 g。p-p38MAPK单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司，IL-1β多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。H-7650透射电镜为日本日立公司产品，数字测氧仪(建德市梅城电化分析仪器厂)，低氧控制程序和低氧舱(天津医科大学)，纯氮(天津六方气体高科技有限公司)。

1.2慢性间歇性低氧大鼠模型的建立[8]每天8：00～16：00将大鼠置于模型舱内，向舱内循环充入氮气和空气，每次循环2 min，连续给予氮气30 s，维持舱内氧体积分数最低至5%，随后均复氧至21%。用数字测氧仪监测舱内氧浓度，使舱内氧浓度维持在规定浓度±0.5%以内。

1.3实验分组将56只雄性SD大鼠随机分成对照组、模型组和葡萄籽原花青素高、低剂量干预组，每组14只。模型组：按1.2方法制备模型；对照组：每天也将动物置于模型舱内，但暴露于正常空气中；高、低剂量干预组：在造模前2周开始每天1次灌胃葡萄籽原花青素200和100 mg·kg-1，直至实验结束。

1.4脑组织超微结构观察在低氧处理第2和6周，每组分别随机抽取2只动物，常规麻醉，开胸、暴露心脏，用混合固定液灌流心脏，断头取脑，取海马区脑组织，参照文献[8]处理，透射电镜下观察神经细胞超微结构并摄片。

1.5学习记忆能力的测定在低氧处理第2和6周，每组分别随机抽取5只动物，按照Smith等[9]的方法，采用Morris水迷宫实验进行学习记忆能力的检测。记录大鼠逃避潜伏期及撤去平台后动物穿越原平台位置的次数(穿台次数)[8]。

1.6脑组织p-p38MAPK和IL-1β蛋白的检测水迷宫实验后处死大鼠，迅速取双侧海马区脑组织，Western blot法检测p-p38MAPK和IL-1β蛋白，抗体分别稀释2 000和1 000倍。ECL 显色。采用Gel-Doc凝胶成像分析系统分析蛋白条带的灰度值，以目的蛋白与内参β-actin条带平均灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。

1.7统计学处理应用SPSS 10.0对数据进行处理，4组大鼠水迷宫实验逃避潜伏期和穿台次数、脑组织p-p38MAPK和IL-1β蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组大鼠海马区神经细胞超微结构的改变对照组神经细胞形状规则，胞质内线粒体丰富，胞核形状规则，核膜完整，染色质均匀，电子透明度高。模型组神经细胞外形不规则，多数线粒体嵴断裂、减少甚至出现大量空泡，有的消失或难以辨认，染色质聚集靠边。葡萄籽原花青素干预组神经细胞超微结构较模型组改善，高剂量干预组改善尤为明显。见图1。

2.2 4组大鼠学习记忆能力的比较见表1。与对照组相比，模型组大鼠逃避潜伏期延长，穿台次数减少；与模型组比较，葡萄籽原花青素干预组大鼠逃避潜伏期缩短，穿台次数增加，且高剂量干预组变化更为显著。

2.3 4组大鼠海马区脑组织p-p38MAPK和IL-1β的表达见图2、表2。与对照组比较，模型组海马区脑组织p-p38MAPK和IL-1β蛋白表达水平增高；与模型组比较，葡萄籽原花青素干预组海马区脑组织p-p38MAPK和IL-1β蛋白的表达水平均降低，且高剂量干预组变化更为显著。

图1 4组大鼠海马区脑组织神经细胞超微结构(电镜，×20 000)

图2 p-p38MAPK和IL-1β蛋白免疫印迹结果

表1 4组大鼠水迷宫实验结果的比较(n=5)

组别逃避潜伏期/s2周6周穿台次数2周6周对照组25．66±2．9725．40±3．0011．57±2．1810．94±2．40模型组62．15±7．44∗68．42±7．91∗4．42±1．25∗2．87±0．92∗低剂量干预组49．17±8．87∗△56．47±6．98∗△5．81±1．60∗△6．32±1．12∗△高剂量干预组32．76±2．02∗△▲38．86±3．18∗△▲7．68±1．61∗△▲9．12±1．18∗△▲F40．17036．42423．19126．250P<0．001<0．001<0．001<0．001

*:与对照组比较，P<0.05；△:与模型组比较，P<0.05；▲:与低剂量干预组比较，P<0.05。

表2 4组大鼠海马区脑组织p-p38MAPK和IL-1β蛋白表达的比较(n=5)

*:与对照组比较，P<0.05；△:与模型组比较，P<0.05；▲:与低剂量干预组比较，P<0.05。

3 讨论

OSAHS以反复发生的低氧/再复氧为特征，在此过程中，强烈的氧化应激以不同方式促进了炎症反应的发生[10-11]。p38MAPK是调控炎症反应的关键信号调控激酶，脂多糖、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1和缺血再灌注等炎性刺激均可介导p38MAPK的激活，其活化可介导炎症因子如TNF-α、IL-1、核因子-κB(NF-κB)等生成增多，形成恶性循环[12]。IL-1β可通过NF-κB激活巨噬细胞及其他细胞分泌粘附因子、IL-6、IL-8等，是缺血缺氧后脑组织炎症损伤转变的基础[13]。

该研究结果显示，慢性间歇性低氧模型大鼠海马区脑组织超微结构受损严重，大鼠学习记忆能力下降，同时脑组织p-p38MAPK和IL-1β的表达增加，说明炎症反应在间歇性低氧导致的神经损伤中发挥关键作用；葡萄籽原花青素可减轻模型大鼠海马区脑组织超微结构的损伤，改善大鼠学习记忆能力，抑制大鼠脑组织内p38MAPK的活性和炎症因子IL-1β的表达，且高剂量干预组表现更为显著。葡萄籽原花青素是一种广泛存在于各种植物中的天然抗氧化剂，其带有的多电子羟基使电子在分子中较稳定，两个脂肪族羟基具有良好的水溶性，该分子结构特征使其能够阻断自由基生成，有效清除超氧阴离子和羟基等自由基，清除能力与超氧化物歧化酶相当；且葡萄籽原花青素对氧自由基的清除能力与剂量呈线性关系[14]。作者认为，葡萄籽原花青素可抑制间歇性低氧大鼠脑内的炎症反应。

国内谭毓治等[15]曾报道葡萄籽原花青素能改善D-半乳糖所致衰老小鼠的学习记忆能力和信息保持能力，这些作用与其能降低血液和脑组织中过氧化脂质水平有关。作者认为，葡萄籽原花青素可能通过抑制p38MAPK信号活化、减少IL-1β表达而改善间歇性低氧大鼠的认知行为。研究[16-17]认为p38MAPK信号的活化对学习记忆的影响主要表现为负性调节作用，其活化后可导致神经细胞死亡，亦可直接损伤海马神经突触可塑性，导致长时程增强的受损，从而致空间学习能力受损。IL-1β可影响脑细胞对神经活性物质的释放和再摄取，调控输入与输出关系的反应环路，影响突触的可塑性。IL-1β异常升高时可抑制海马部位神经元的兴奋性和突触功能，减少海马区有关神经营养因子的生成，间接抑制长时程增强，从而导致认知功能损伤[16]。

总之,该研究结果表明，葡萄籽原花青素可以通过降低海马区脑组织p38MAPK信号活化、减少IL-1β的表达，减轻炎症反应，从而改善间歇性低氧导致的认知功能损伤。葡萄籽原花青素具有多种药理活性,其改善间歇性低氧致神经损伤的其他机制有待进一步探讨。

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(2013-04-15 收稿 责任编辑 王 曼)

Effect of grape seed proanthocyanidin on inflammation and learning memory capacity of rat model of chronic intermittent hypoxia

ZHAOYaning1，2)，CAOShuhua3),GUOXia2),WANGHongyang2)

1)TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine，Tianjin300000 2)RehabilitationCollege,HebeiUnitedUniversity,Tangshan063000 3)EmergencyMedicineUnit,TianjinFirstCentralHospital,Tianjin300000

intermittent hypoxia; p38MAPK; IL-1β; learning memory capacity; grape seed proanthocyanidin; rat

Aim: To investigate the effect of grape seed proanthocyanidin on inflammation and learning memory capacity of rat with chronic intermittent hypoxia. Methods: A total of 56 male SD rats were randomly allocated into four groups: control group, model group, low and high dose of grape seed proanthocyanidin groups. Rats in control group were exposed in air，those in the other 3 groups suffered from intermittent hypoxia conditions for 6 weeks. 2 weeks before the hypoxia treatment, rats in low and high dose of grape seed proanthocyanidin groups were began to intragastricly administrate grape seed proanthocyanidin at dose of 100 and 200 mg·kg-1, once per day,respectively. At the 2nd and 6th week of hypoxia treatment,neuron pathology in hippocampal region was observed using electron microscope,the expressions of phosphorylated p38MAPK and IL-1β proteins were detected by Western blot,and the learning memory capacity of rats were assessed by the Morris water maze. Results: Compared with those of control group, the microstructure of neuron was severely injured,the expressions of phosphorylated p38MAPK and IL-1β proteins significantly increased,and the escaping latency was prolonged,the frequency of crossing the platform decreased in the model group(P<0.05). Compared with those of the model group, neuron pathology changes significantly improved, phosphorylated p38MAPK and IL-1β expressions in brain tissue decreased, the escaping latency was shorter and the frequency of crossing the platform increased in the 2 grape seed proanthocyanidin groups(P<0.05),and the above mentioned changes in the high dose group were more significant(P<0.05). Conclusion: Grape seed proanthocyanidin could attenuate inflammation and improve learning memory capacity in rats with intermittent hypoxia.

*河北省教育厅重点资助项目 ZH2012046

R767

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.009