CYP2D6基因多态性对帕罗西汀在河南汉族健康受试者体内药代动力学的影响

周 霖，薛文华，张海朋，刘克锋，赵 杰

郑州大学第一附属医院药学部 郑州 450052

CYP2D6基因多态性对帕罗西汀在河南汉族健康受试者体内药代动力学的影响

周 霖，薛文华，张海朋，刘克锋，赵 杰#

郑州大学第一附属医院药学部 郑州 450052

#通讯作者，男，1969年5月生，博士，教授，主任药师，研究方向：临床药学、药物基因组学与药代动力学，E-mail:zhaojie@zzu.edu.cn

CYP2D6；帕罗西汀；基因多态性；药代动力学；河南；汉族

目的：研究CYP2D6基因多态性对帕罗西汀在河南汉族健康受试者体内药代动力学的影响。方法河南汉族健康受试者48人，使用PCR-RFLP技术对其进行CYP2D6基因型检测。受试者单剂量(7.5 mg)口服甲磺酸帕罗西汀胶囊后，收集120 h内的系列血样，用建立的LC-MS/MS法测定血浆帕罗西汀浓度，绘制药-时曲线，进行药代动力学分析。结果男性CYP2D6*1/*1型受试者9人，CYP2D6*1/*10型21人；女性CYP2D6*1/*1型受试者5人，CYP2D6*1/*10型13人；未检测到CYP2D6*10/*10型；男、女CYP2D6基因型分布差异无统计学意义(χ2=0.027，P>0.999)。与CYP2D6*1/*1型男性受试者比较，CYP2D6*1/*10型男性受试者tmax、t1/2无明显变化(Z=1.145，t=1.400，P>0.05)，CL(F)、Vd降低(Z=2.557，t=2.104，P<0.05)，ρmax、AUC0-120和AUC0-∞增加(Z=2.421、2.512、2.557，P<0.05)。与CYP2D6*1/*1型女性受试者比较，CYP2D6*1/*10型女性受试者ρmax、tmax、t1/2及Vd无明显变化(Z=1.992、1.921，t=2.117、1.905，P>0.05)，但CL(F)降低(Z=2.021，P<0.05)，AUC0-120和AUC0-∞增加(Z=2.021、2.021，P<0.05)。结论CYP2D6*10突变等位基因可影响甲磺酸帕罗西汀在河南汉族健康人群体内的代谢。

帕罗西汀为选择性5-HT摄取抑制剂，7.5 mg的甲磺酸帕罗西汀于2013年6月28日被FDA批准用于治疗中度至严重伴绝经血管舒缩症状，同时也是第一个被FDA批准的非激素治疗、缓解更年期女性潮热症状的药物，但目前作用机制尚不明确。帕罗西汀在健康人体内吸收和消除较慢，主要经过人体的药物代谢酶CYP2D6代谢，个体之间的药代动力学参数差异较大[1-3]。CYP2D6有很多种突变类型(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm)，其在亚洲人群中的突变类型主要是CYP2D6*10[4]。CYP2D6*10主要是由于外显子1的188位点发生了C→T的点突变，致使蛋白酶34位上的脯氨酸(Pro)变成丝氨酸(Ser)，形成了活性低且不稳定的代谢酶[5]。目前，有关CYP2D6基因多态性与帕罗西汀代谢个体差异的关系的研究鲜有报道。因此，作者建立了检测帕罗西汀血浆浓度的LC-MS/MS法，应用该方法对河南汉族健康志愿者48人进行了检测，对不同CYP2D6基因型受试者帕罗西汀体内代谢的药代动力学参数进行了比较、分析，以期为临床个体化用药提供理论指导。

1 对象与方法

1.1研究对象河南汉族健康志愿者48人，其中女18人，男30人。入选标准：年龄18～45岁，体重50～90 kg，体重指数(BMI)18～30 kg/m2，无烟酒等不良嗜好，无心、肝、脾、肺、肾、消化系统等疾病史，心电图、血常规、血压、肝肾功能、尿常规、传染病等实验室检查无异常，近2周内没有服用任何处方药，均签署知情同意书。知情同意书以及试验方案经过郑州大学第一附属医院伦理委员会审查批准。

1.2药物与试剂甲磺酸帕罗西汀胶囊，规格7.5 mg/粒，由Noven药业有限公司生产。甲磺酸帕罗西汀对照品(批号FN102209-01)、甲磺酸帕罗西汀D6(内标，批号FN031709-01)由Cerilliant公司生产。甲醇、乙腈、正己烷、甲酸为HPLC级，氢氧化钠为优级纯，纯化水(18.2 MΩ·cm)、血浆以及K2-EDTA(上海Bioreclamation公司)。

1.3CYP2D6基因型检测取研究对象外周静脉血5 mL置于K2-EDTA抗凝管中。用DNA提取试剂盒按照操作说明提取DNA。设计特异性引物[6]，利用PCR-RFLP对CYP2D6基因进行分型。型别包括野生纯合子CYP2D6*1/*1、杂合子CYP2D6*1/*10，突变纯合子CYP2D6*10/*10。

1.4帕罗西汀血浆浓度LC-MS/MS测定方法的建立及方法学确证[7]

1.4.1 血浆样品的处理 精密吸取200 μL血浆样品至1.5 mL塑料离心管中，加入20 μg/L的内标溶液20 μL，混匀，加入0.1 mol/L的NaOH溶液200 μL，混匀，再加入正己烷2 mL，涡旋10 min，于离心机中以3 500 r/min离心10 min，取有机层，吹干，待测。

1.4.2 LC-MS/MS系统的建立 API-5000型三重四级杆串联质谱仪(美国AB Sciex 公司),HPLC(Shimadzu公司)，自动进样器。色谱条件：色谱柱为XbridgeTMC18, 30×4.6 mm，3.5 μm；流动相为体积比为1:1的乙腈/甲醇缓冲液(含质量分数0.05%的甲酸)；流速为1.0 mL/min；自动进样器温度为5 ℃；进样量20 μL。质谱条件：选用电喷雾离子源，正离子电模式下，采用多反应监测的质谱扫描方式；帕罗西汀的检测离子为m/z 330.2→192.2，内标的检测离子为m/z 336.2→198.2。质谱参数：雾化温度500 ℃，喷雾电压5 000 V，碰撞气6 L/min，帘气15 L/min，雾化气50 L/min，辅助气40 L/min。 色谱图用Analyst 1.4.2程序进行分析。

1.4.3 标准曲线的绘制 精密吸取空白血浆180 μL，分别加入系列浓度的帕罗西汀对照品并混匀，配制成相当于血浆帕罗西汀质量浓度分别为0.02、0.04、0.20、1.00、5.00、10.00、16.00、20.00 μg/L的质控样品，按1.4.1处理后，按1.4.2进样检测，记录帕罗西汀的峰面积As和内标物峰面积Ai。以质量浓度ρ为X、以f(f=As/Ai)为Y进行权重回归，权重系数为1/ρ2。

1.4.4 精密度、回收率和稳定性测定 ①精密度：分别配置0.06(低质量浓度)、3.00(中质量浓度)、15.00(高质量浓度) μg/L的帕罗西汀质控样品各6份，分3批进行测定，计算日内和日间变异。②回收率：分别配置低、中、高3种质量浓度的帕罗西汀质控样本各3份，进行测定；另外取6份不同来源的双空白血浆200 μL，加入配制成低、中、高质量浓度的质控样品，按1.4.1处理后，进样检测；根据两次测定结果，计算提取回收率。③稳定性：分别配制低、中、高质量浓度的帕罗西汀质控样品，于室温下放置22 h，反复冻融4次，-70 ℃冻存36 d后检测，考察方法的稳定性。

1.4.5 基质效应 取6份不同来源的双空白血浆，分别配制成低、中、高质量浓度的帕罗西汀质控样品，按1.4.1处理后，按1.4.2进样检测、记录帕罗西汀和内标物的色谱峰面积As(A)与Ai(A)。另取纯化水200 μL至1.5 mL塑料离心管中，共18个样品，按1.4.1操作，按1.4.2进样测定，记录帕罗西汀和内标物的色谱峰面积As(B)与Ai(B)。帕罗西汀的基质效应ME=As(A)/As(B)×100%，内标的基质效应MEi=Ai(A)/Ai(B)×100%。

1.5研究对象帕罗西汀血药浓度的测定研究对象单剂量口服甲磺酸帕罗西汀胶囊7.5 mg(240 mL室温水送服)，于服药前90 min内和服药后1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、20.0、24.0、36.0、48.0、72.0、96.0、120.0 h于肘静脉采集血样5 mL，置于K2-EDTA化的采血管中，立即放入碎冰中，在采集后30 min内置低温(4 ℃)离心机内3 500 r/min离心10 min，分离后得血浆，于-70 ℃冰箱中冷冻保存。应用1.4中建立的 LC-MS/MS法测定帕罗西汀血药浓度，绘制药-时曲线，曲线的主要药代动力学参数用DAS 2.0计算。

1.6统计学处理应用SPSS 17.0进行统计学处理，同一性别不同基因型受试者各药代动力学参数的比较采用两独立样本t检验或非参数秩和检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1一般资料男性受试者中，CYP2D6*1/*1型9人，CYP2D6*1/*10型21人；女性受试者中，CYP2D6*1/*1型5人，CYP2D6*1/*10型13人；未检测到CYP2D6*10/*10型。男、女CYP2D6基因型分布差异无统计学意义(χ2=0.027，P>0.999)。不同基因型受试者的年龄、体重、身高差异均无统计学意义，见表1。

表1 不同基因型受试者一般资料的比较

2.2LC-MS/MS方法的评价色谱图见图1，可见帕罗西汀和内标的保留时间分别为1.21 min和1.20 min。标准曲线为Y=0.484 872X+0.000 335(R2=0.999 5)，检测范围为0.02～20.00 μg/L。帕罗西汀低、中、高3个质量浓度的质控样品测得的日内变异分别为5.0%、3.3%和4.5%，日间变异分别为3.4%、5.0%和4.3%，提取回收率分别为53.1%、 52.6%和46.1%。样品在室温下放置22 h，反复冻融4次，-70 ℃冻存36 d条件下稳定。低和高质量浓度质控样品的基质效应分别为(103±5)%和(102±5)%。

图1 帕罗西汀(上)和内标(下)的色谱图

2.3不同CYP2D6基因型受试者帕罗西汀药代动力学参数的比较药-时曲线见图2，药代动力学参数的比较见表2、3。

图2 单剂量口服甲磺酸帕罗西汀7.5 mg后的药-时曲线

上：男性；下：女性；-●-：CYP2D6*1/*10型；-■-：CYP2D6*1/*1型。

表2 不同CYP2D6基因型男性受试者帕罗西汀药代动力学参数的比较

*：两独立样本t检验。

表3 不同CYP2D6基因型女性受试者帕罗西汀药代动力学参数的比较

*：两独立样本t检验。

3 讨论

帕罗西汀为2013年被FDA批准用于临床的药物。帕罗西汀经口服后可被完全吸收，食物对其吸收影响不大；在临床条件下，其血浆蛋白结合率约为95%，可迅速在体内各组织中广泛分布，包括中枢神经系统；多次给药后大约12 d可达到稳态血药浓度，达峰时间为6 h；在7.5 mg剂量下帕罗西汀在人体内代谢呈非线性动力学[1]。

药物在人体内的转化过程主要靠药物代谢酶来完成。代谢帕罗西汀的药物酶为CYP2D6，该酶容易饱和，故帕罗西汀可出现过量蓄积现象[1]。酶的遗传多态性导致了人群中酶的结构和含量不同，最终的结果是相同的药物在不同人体内的药代动力学参数具有差异性，从而出现机体对药物的不同反应。CYP2D6的突变类型较多，其中*2、*3、*4、*5、*6、*10等位基因在高加索人群中都有发现，*2和*17主要存在于非洲人群中，而*10是亚洲人群的主要突变类型[4]。CYP2D6*10在中国人群中的频率为52.53%，显著高于高加索人群(1.53%)，稍高于韩国人群(45.00%)[8-9]。因此，作者对河南健康汉族人群中不同CYP2D6基因型受试者帕罗西汀的药代动力学参数进行了比较。

作者首先对48个受试者进行了CYP2D6基因多态性检测，结果CYP2D6*1/*1型共检出14(29.17%)人，其中男9人，女5人；*1/*10型共检出34(70.83%)人，其中男21人，女13人；未检测到*10/*10型。男、女CYP2D6基因型分布差异无统计学意义。作者建立了测定血浆帕罗西汀浓度的LC-MS/MS方法，方法学考察结果显示，该方法的测定精密度、回收率和稳定性都较好，能够满足研究的需要。进一步的药代动力学分析结果显示，在男性受试者中，与CYP2D6*1/*1基因型者比较，CYP2D6*1/*10型者tmax、t1/2无明显变化，CL(F)、Vd降低，ρmax、AUC0-120和AUC0-∞增加。在女性受试者中，与CYP2D6*1/*1基因型者比较，CYP2D6*1/*10型者ρmax、tmax、t1/2及Vd无明显变化，CL(F)降低，AUC0-120和AUC0-∞增加。结果说明，无论男性还是女性，*10突变等位基因可使帕罗西汀在健康人体中的代谢减慢。王蒙等[10]也对CYP2D6基因多态性与帕罗西汀在人体内代谢的关系进行了相关研究，结果也表明CYP2D6基因多态性可影响帕罗西汀在健康人体中的代谢。

近年来，应用基因多态性指导临床合理用药的方法已经被广泛接受。该研究说明，应用基因多态性与血药浓度检测相结合的方法可以预测新上市的药物在某相关基因不同基因型的人群中的药代动力学表现，根据基因多态性制定药物治疗方案，可以弥补单纯应用血药浓度监测来制定个体化用药方案的不足。同时，该研究也为个体化临床用药提供了新的思路和方法[11]。

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(2014-06-11收稿 责任编辑王 曼)

Influence of CYP2D6 genetic polymorphism on pharmacokinetics of paroxetine in Henan Han healthy subjects

ZHOULin，XUEWenhua，ZHANGHaipeng，LIUKefeng,ZHAOJie

DepartmentofPharmacy,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

CYP2D6;paroxetine;genetic polymorphism;pharmacokinetics；Henan；Han population

Aim: To investigate the influence of CYP2D6 genetic polymorphism on pharmacokinetics of paroxetine in Henan Han healthy people.Methods: A total of 48 Han healthy volunteers from Henan Province were subjected to detect genetic polymorphied by PCR-RFLP method. The volunteers were given a single oral dose of paroxetine mesylate capsule(7.5 mg), and blood samples were collected at different time points until 120 h. The concentrations of paroxetine in plasma were measured by LC-MS/MS method, and the pharmacokinetics was analyzed.Results: There were 9 males with CYP2D6*1/*1, 21 with CYP2D6*1/*10,5 females with CYP2D6*1/*1 and 13 with CYP2D6*1/*10, and the distribution of CYP2D6 genetic polymorphism between the male and the female had no difference(χ2=0.027，P>0.999). Compared with the male with CYP2D6*1/*1,tmax,t1/2of the male CYP2D6*1/*10 subjects had no changes(Z=1.145，t=1.400，P>0.05),CL(F) andVddecreased(Z=2.557，t=2.104，P<0.05),ρmax,AUC0-120andAUC0-∞increased(Z=2.421,2.512,2.557，P<0.05). Compared with the female CYP2D6*1/*1 subjects,ρmax,tmax,t1/2andVdof the females with CYP2D6*1/*10 had no changes(Z=1.992,1.921，t=2.117,1.905，P>0.05),CL(F) decreased(Z=2.021，P<0.05),AUC0-120andAUC0-∞increased(Z=2.021,2.021，P<0.05).Conclusion: The mutation CYP2D6*10 could lead to the metabolic phenotype changes of paroxetine mesylate in Henan Han healthy subjects.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.06.020

R969.1