阻断氯离子通道对荷Hep-2细胞瘤裸鼠移植瘤生长、细胞凋亡及Oct4和CD133蛋白表达的影响*

余文发，赵玉林，王 萍，鲁保才，马慧敏，王慧敏

1)新乡医学院第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科 卫辉 453100 2)郑州大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科 郑州 450052 3)新乡医学院第三附属医院功能检查科 新乡 453003

阻断氯离子通道对荷Hep-2细胞瘤裸鼠移植瘤生长、细胞凋亡及Oct4和CD133蛋白表达的影响*

余文发1)△，赵玉林2)，王 萍3)，鲁保才1)，马慧敏1)，王慧敏1)

1)新乡医学院第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科 卫辉 453100 2)郑州大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科 郑州 450052 3)新乡医学院第三附属医院功能检查科 新乡 453003

△男，1972年3月生，博士，副主任医师，副教授，研究方向：头颈肿瘤的防治，E-mail:yuwenfa197288@aliyun.com

喉肿瘤；氯离子通道；Oct4；CD133；裸鼠；Hep-2

目的：研究阻断氯离子通道对荷Hep-2细胞瘤裸鼠移植瘤的抑制作用及可能机制。方法以Hep-2细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，应用不同浓度(0、10、50、100和150 μmol/L)的氯离子通道阻断剂(NPPB)处理4周，每组6只。观察移植瘤体积的变化，采用TUNEL染色检测移植瘤组织细胞凋亡情况，免疫组化法检测移植瘤组织Oct4和CD133蛋白的表达。结果不同浓度的NPPB组间移植瘤体积、细胞凋亡指数及Oct4和CD133蛋白的阳性表达率差异均有统计学意义(F=7.361、126.385,P均<0.05); 与对照组(0 μmol/L NPPB组)相比，50、100和150 μmol/L NPPB组移植瘤体积减小，细胞凋亡指数升高，Oct4和CD133蛋白的阳性表达率降低(P<0.05或0.005)。结论体内阻断氯离子通道可抑制荷Hep-2细胞瘤裸鼠移植瘤的生长，诱导肿瘤细胞凋亡，其机制可能与降低Oct4和CD133蛋白的表达有关。

喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤，近年来其发病率及死亡率呈明显升高趋势，但其发生发展机制尚未完全明了[1]。研究[2]显示恶性肿瘤的发生发展伴随细胞信号传导的异常，而细胞信号传导与离子通道的功能状态密切相关。肿瘤干细胞理论认为肿瘤的发生是由极少数具有无限增殖能力的细胞增殖而形成[3]。Oct4是多能性干细胞的标志，在维持胚胎干细胞的全能性及多向分化能力方面发挥着重要作用[4]。CD133也是近年来发现的肿瘤干细胞表面标志物[5]。作者的前期研究[6-7]表明阻断氯离子通道可抑制体外培养的人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖和诱导凋亡。为进一步探讨阻断氯离子通道对喉癌的抑制作用及其机制，该研究采用Hep-2细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，观察不同浓度的氯离子通道阻断剂5-硝基-2-(3苯丙氨基)苯甲酸[5-nitro-2-(3-phenylpropylamino) benzoate acid, NPPB]对移植瘤生长、细胞凋亡及Oct4和CD133蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1材料Hep-2细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。30只BALB/C先天性细胞免疫缺陷nu/nu裸小鼠，雌性，4～6 周龄，体重17～22 g，购自上海实验动物研究中心。Oct4单克隆抗体(ZM-0233)和CD133多克隆抗体(ZA-0426)均为即用型抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2裸鼠皮下移植瘤模型的建立选取对数生长期的Hep-2细胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化，0.01 mol/L PBS洗涤2次，制成1×108mL-1细胞悬液备用。在超净工作台内，以TB空针抽取细胞悬液注入裸鼠右侧腋部皮下，穿刺点距注射部位1.2 cm，每只鼠皮下接种1点，每点0.2 mL。接种后观察。接种部位皮下长出粟粒大小的硬结为移植瘤模型建立成功。接种后每天观察裸鼠精神、饮食、活动和肿瘤形成情况。

1.3实验分组接种2周后30只裸鼠均出现粟粒大小肿瘤。随机分为5组，每组6只，即对照组和不同浓度NPPB组(10、50、100和150 μmol/L NPPB)。NPPB组每天向肿瘤组织局部注射相应浓度的NPPB 50 μL，对照组注射同体积PBS(0.01 mol/L, pH 7.4)，共4周。

1.4移植瘤体积的观测给药前和给药开始后每周用游标卡尺测量瘤体长径(a)和短径(b)，根据公式V=1/6πab2计算移植瘤体积。

1.5标本的取材治疗4周后拉颈处死小鼠，迅速取出肿瘤，分为2部分。一部分用作TUNEL原位细胞凋亡检测，另一部分切成大小为0.5～1.0 mm3的组织块，甲醛溶液固定24 h后常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，用于病理学诊断和Oct4、CD133蛋白检测。

1.6移植瘤组织细胞凋亡检测依照武汉博士德生物工程公司提供的TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒说明步骤进行。计算凋亡指数(AI)。

1.7移植瘤组织中Oct4和CD133蛋白的检测采用免疫组化PV9000二步法进行Oct4、CD133蛋白的检测，分别以肝癌、精原细胞瘤作为CD133、Oct4的阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。CD133主要表达于胞膜，在胞浆也有表达，而Oct4主要表达于胞核。结果判断采用半定量分析法[8]。①按细胞染色程度：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。②按阳性细胞百分比：每例标本选取5个高倍视野，计数100个细胞中的阳性细胞，取均值。阳性细胞百分比<5%为0分，5%～为1分，26%～为2分，≥50%为3分。两项得分相乘，≤1分为阴性，≥2分为阳性。

1.8统计学处理应用SPSS 16.0处理数据。采用单因素方差分析比较不同浓度NPPB处理4周后移植瘤体积和AI的差异，两两比较采用LSD-t检验。采用精确概率法比较不同浓度NPPB处理4周后移植瘤组织中CD133和Oct4蛋白的表达。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组移植瘤生长情况30只裸鼠Hep-2细胞接种2周后均出现粟粒大小肿瘤，皮下移植部位全部形成类圆形肿瘤，隆起于皮肤表面，成瘤率100%。

2.2各组移植瘤体积比较NPPB能有效抑制喉癌移植瘤的生长，见表1。

表1 各组移植瘤体积比较 cm3

F=7.361,P=0.015；#：与对照组比较，P<0.05。

2.3各组移植瘤组织中AI和Oct4、CD133蛋白表达的比较见图1、表2。

图1 各组移植瘤组织细胞凋亡情况(TUNEL，×400)

表2 各组移植瘤组织中AI和Oct4、CD133蛋白表达的比较

*:各组间两两比较，P均<0.05；△：精确概率法；#：与对照组比较,P<0.005。

3 讨论

肿瘤干细胞理论认为肿瘤干细胞具有自我更新和多向分化潜能，是肿瘤复发和转移的根源，而细胞离子通道结构和活性的改变与肿瘤细胞增殖和凋亡亦密切相关。氯离子通道是较为重要的一种离子通道。氯离子通道阻滞剂可以抑制卵巢癌、鼻咽癌等肿瘤细胞周期的进展，抑制细胞增殖[8-9]；在多种细胞系如SiHa和HeLa中发现，阻断氯离子通道可诱导细胞凋亡[10-11]。另外，肺癌干细胞中也存在容积激活氯离子通道[12]。

作者观察了氯离子通道阻滞剂NPPB对裸鼠移植瘤体积及细胞凋亡的影响，结果显示，随NPPB作用浓度的增加，裸鼠移植瘤体积减小，细胞AI升高。人类表达Oct4基因的成体干细胞是癌变起源的一种靶细胞，Oct4在肿瘤发生过程中发挥着重要作用。肿瘤形成起始时一些不可逆的基因改变可以阻止Oct4的消失，保留了细胞异常自我更新的能力，无限制的扩增即形成肿瘤。而CD133是传统血液肿瘤、造血干细胞及内皮细胞的标志物。在急性髓系白血病、肝癌、脑肿瘤、结肠癌等肿瘤中，裸鼠移植实验均证明只占肿瘤细胞极少数的CD133+细胞具有致瘤能力，CD133+细胞与不良预后和较强的细胞增殖能力有关[13]。卫旭东等[14]用免疫磁珠分选技术从喉癌Hep-2细胞系分离纯化出CD133+肿瘤细胞，初步证明CD133为喉癌起始细胞的标志之一。该研究结果表明：喉癌裸鼠移植瘤组织中Oct4和CD133蛋白阳性表达率在氯离子通道阻断后均明显下降。其原因可能为NPPB阻断后Oct4和CD133信号传导通路受到影响，进而影响喉癌细胞的干细胞特性和分化。但氯离子通道与喉癌发生发展的确切关系仍需更为深入的研究。

综上所述，阻断氯离子通道可抑制裸鼠Hep-2移植瘤的生长，诱导移植瘤细胞凋亡，其机制可能与降低Oct4和CD133蛋白的表达有关。

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(2013-06-10收稿 责任编辑徐春燕)

Effects of blocking chloride ion channel on growth of xenograft tumor,cell apoptosis and expressions of Oct4 and CD133 in Hep-2 xenograft tumor of nude mice

YUWenfa1)，ZHAOYulin2)，WANGPing3)，LUBaocai1)，MAHuimin1)，WANGHuimin1)

1)DepartmentofOtolaryngology,theFirstAffiliatedHospital，XinxiangMedicalCollege,Weihui453100

2)DepartmentofOtolaryngology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

3)DepartmentofFunctionalExamination,theThirdAffiliatedHospital，XinxiangMedicalCollege,Xinxiang453003

laryngeal neoplasm;chloride ion channel;Oct4;CD133;nude mouse;Hep-2

Aim: To study the effects of blocking chloride ion channel on human laryngeal carcinoma xenograft tumor in nude mice and its possible mechanism. Methods: Hep-2 cells were seeded subcutaneously into the nude mice to establish human laryngeal carcinoma xenograft tumor model and treated with NPPB at different concentrations(0,10,50,100 and 150 μmol/L), respectively for 4 weeks. The volume changes of the xenograft tumors were studied. TUNEL staining was used to determine cell apoptosis in xenograft tumor tissue. Immunohistochemistry staining was used to detect the expressions of Oct4 and CD133. Results: The volume of the tumors, apoptosis index, and the positive expression rates of Oct4 and CD133 in the 5 groups had significant differences(F=7.361,126.385，P<0.05); compared with 0 μmol/L NPPB group,the volume of the tumors decreased, the apoptosis index increased, and the positive expression rates of Oct4 and CD133 decreased in 50,100,and 150 μmol/L NPPB groups(P<0.05 or 0.005).Conclusion: Blocking the chloride ion channel may inhibit the growth of xenograft tumor, induce apoptosis of Hep-2 cells in the xenograft tumors through down-regulating the expressions of Oct4 and CD133.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.005

*河南省卫生科技创新人才工程 2010141；河南省高等学校青年骨干教师资助计划 2010GGJS-120

R739.65