河南省间日疟原虫环子孢子蛋白基因序列分析*

刘 颖，周瑞敏，赵玉玲，赵旭东，许汴利，张红卫

河南省疾病预防控制中心寄生虫病所 郑州 450016

河南省间日疟原虫环子孢子蛋白基因序列分析*

刘 颖，周瑞敏，赵玉玲，赵旭东，许汴利，张红卫#

河南省疾病预防控制中心寄生虫病所 郑州 450016

#通讯作者，男，1969年9月生，博士，副主任医师，研究方向：寄生虫病防治，E-mail:zhwei69@163.com

河南；间日疟原虫；环子孢子蛋白；基因型

目的：探讨河南省间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)的基因型分布。方法收集经镜检确诊的河南省2011年间日疟患者血标本34份，24例患者为河南籍，发病前无外出到其他省份或国家的历史，10例患者有明确外出史。用核酸提取试剂盒提取滤纸血中疟原虫DNA，进行巢式PCR扩增，对扩增产物进行序列测定和基因进化特征分析。结果24份本地病例分离所得的本地株间日疟原虫CSP均属于PV-Ⅰ型，又可分为A和B 2个基因型；氨基酸同源性分析结果显示，A型与VK210的同源性达90.6%～94.2%，B型为71.6%。结论河南省间日疟原虫CSP的基因型均属PV-Ⅰ型，可以进一步分为2个基因型，与其他国家的基因型显著不同。

疟疾是以按蚊为传播媒介的重要虫媒传染病。间日疟原虫(Plasmodiumvivax,P.vivax)广泛分布于亚洲、南美洲的多个地区[1-2]，包含许多株、型，不同地理株疟原虫的生物学特性、对媒介按蚊的感染力、对人类宿主的免疫原性以及对抗疟药物的敏感性都有明显的差异，并直接影响间日疟的流行过程，关系到防治策略和措施的制定[3]。河南省历史上曾是疟疾高发区，20世纪70年代发病率达到17%[4],经过广大疟疾防治工作者几十年的艰苦努力，全省疟疾发病已降至较低水平[5]，到2012年已无本地病例报告，但是输入性病例在持续增加，传播媒介依然存在，这些输入性病例不但会成为重要的传染源而引起间日疟的再度流行[6]，还可能会引起不同地理株疟原虫基因的重组，使间日疟原虫种群复杂化[7]，也使得河南省的疟疾防治工作面临新的挑战。间日疟原虫环子孢子蛋白(circumsporozoite protein，CSP)中央重复单元具有种属特异性，是研究得较深入、应用较频繁的一个基因分型标志[8]。为了解河南省间日疟原虫的基因型特点，作者对河南省2011年经镜检确诊的间日疟患者的疟原虫分离株进行了CSP基因序列分析，报道如下。

1 材料与方法

1.1标本来源2011年1月～12月，在河南省全省范围内共收集到34份经镜检确诊为间日疟患者的血标本,均来自河南省疟疾参比实验室。其中24例患者是河南籍，分别来自周口、南阳、商丘、驻马店，发病前没有外出到其他省份或国家的历史，被视为“本地病例”，其疟原虫分离株称为“本地株”；10例发病前有明确的外出至柬埔寨、缅甸、腾冲、印度的历史，被视为“输入病例”，其疟原虫分离株称为“输入株”。

1.2试剂及设备Go Taq Green Master Mix试剂购自Promage公司，琼脂糖购自TaKaRa公司。核酸提取试剂盒购自Qiagen公司，PCR扩增仪、凝胶成像系统为Bio-RAD公司产品。

1.3CSP基因型的检测

1.3.1 DNA提取 将血样制作成滤纸血，常温干燥后，-4 ℃保存备用。用核酸提取试剂盒提取滤纸血中疟原虫DNA，按照说明书操作，获得的DNA于-20 ℃保存。

1.3.2 引物 针对间日疟原虫CSP基因，参照文献[9]设计引物。第一轮引物序列：上游引物(F1)5’-ATGTAGATCTGTCCAAGGCCATAAA-3’，下游引物(R1)5’-TAATTGAATAATGCTAGGACTAACAATATG-3’。第二轮引物序列：上游引物(F2)5’-GCAGAAC CAAAAAATCCACGTGAAAATAAG-3’，下游引物(R2)5’-CCAACGGTAGCTCTAACTTTATCTAGGTAT-3’。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.3 巢式PCR 扩增反应分两轮进行。第一轮：扩增体系为2×PCR Master Mix 10 μL，模板DNA 1 μL，引物F1、R1(10 mol/L)各1 μL，用ddH2O补至20 μL。扩增条件为95 ℃ 4 min;95 ℃ 1 min,58 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共25个循环;72 ℃延伸7 min。产物4 ℃保存备用。第二轮：以第一轮扩增产物为模板。反应体系为2×PCR Master Mix 20 μL，第一轮产物2 μL, 引物F2、R2(10 mol/L)各2 μL,用ddH2O补至40 μL。扩增条件为95 ℃ 4 min;95 ℃ 1 min,62 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共30个循环;72 ℃延伸7 min。产物4 ℃保存备用。取10 μL第二轮扩增产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳，Goldview染色，用凝胶成像系统观察结果。

1.3.4 测序分析 将第二轮扩增产物委托上海生工生物工程有限公司进行双向测序，得到相关序列，使用ChromasPro软件对正、反向序列进行拼接，使用Bioedit对核苷酸序列进行整理并转换成氨基酸序列。从GenBank中调出VK210代表株M28746、VK247代表株M28745[4]、中国株U08977、印度株FJ491128、缅甸株AF316584的序列作为参考，用clustalx软件对这些参考株与实验用分离株的序列进行比对，分析其中央重复单元序列的多态性，并用Mega4.0构建系统进化树。

2 结果

2.1PCR产物鉴定结果34份血样提取的DNA，经二轮PCR扩增后，均按照预期出现了一条750 bp左右的条带,见图1。

图1 巢式PCR 扩增间日疟原虫CSP基因结果

2.2氨基酸序列一致性分析见图2。序列比对结果显示，34株中共观察到13个不同的序列，其中有33株的CSP中央重复单元为GDRA(A/D)GQPA，与VK210一致；有1株为NGAGNQPG，与VK247一致。其中本地株的序列均为VK210型，但序列间又存在不同，可进一步分为7种。输入株中共观察到6个序列，1个与VK247一致，5个与VK210一致，且与本地株不同。

2.3同源性分析从所构建的进化树(图3)可以看出： 24个本地株均属VK210型，但与VK210代表株M28746存在差异，可以分为基因型A和基因型B。基因型A可以进一步划分为A1、A2和A3 3个亚型。同源性分析结果(表1)显示：A1、A2和A3亚型的同源性为93.0%～99.4%，与VK210代表株M28746的同源性为90.6%～94.2%，与中国株U08977(VK210型)的同源性为94.2%～97.7%，与VK247代表株M28745的同源性为16.2%～21.3%。基因型B与VK210代表株M28746的同源性为71.6%，与中国株U08977的同源性为72.3%，与VK247代表株M28745的同源性为38.3%。

图2 序列比对

图3 系统进化树

表1 本地株与其他株CSP的同源性 %

3 讨论

间日疟原虫CSP中央重复单元氨基酸的组成有两种：PV-Ⅰ型是全球普遍流行的优势型，其CSP中央重复单元类似VK210型，已报道的很多分离株都属于此型；PV-Ⅱ型的CSP中央重复单元类似VK247型[10]。不同地区来源的间日疟原虫分离株显现出明显的多态性[11]，因此，分析CSP的序列可以检测疟原虫的地理来源[1]。

此次研究采用巢式PCR法对河南省2011年的34份间日疟患者的血样做了初步分析，结果显示： 34株中，只有一株来自腾冲的输入株CSP中央重复单元是PV-Ⅱ型;其他33株全是PV-Ⅰ型，但重复单位的数目和位置不尽相同，24个本地株由20个及以上(20～22)的重复单位组成，9个输入株由20个以下(17～19)的重复单位组成。24个本地株与10个输入株的CSP中央重复单元九肽重复单位的数目、类型、位置差异均非常显著。24个本地株的序列可以分为两个基因型：基因型A与VK210代表株、中国株的同源性都在90%以上，与VK247代表株的同源性在20%左右；基因型B与VK210代表株、中国株的同源性则在72%左右，与VK247代表株的同源性为38.3%。

通过以上分析，作者认为可以使用CSP作为分子标记来区分疟疾病例是本地病例还是输入病例。该研究选用的中国参考株U08977与河南省的CSP基因型差异很明显，可能是因为U08977采自广西北部与贵州边界[5]，该地与河南省在纬度、气候等方面都存在很大的差异，而河南省与周边省份的间日疟原虫CSP基因型是否存在差异，还有待于进一步的研究。

[1]Choi KM,Choi YK,Kang YA,et al.Study of the genetic discrimination between imported and autochthonous cases of malaria in South Korea[J].J Travel Med,2011,18(1)：63

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[5]刘颖,周瑞敏,苏云普.河南省2011年疟疾疫情分析[J].现代预防医学,2013,40(15):2900

[6]姚立农,阮卫,陈华良,等.浙江本地感染疟疾病例分子流行病学特征[J].浙江预防医学,2009,21(10):1

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(2013-09-05收稿 责任编辑王 曼)

Genetic sequence analysis of circumsporozoite protein ofPlasmodiumvivaxfrom Henan Province

LIUYing,ZHOURuimin,ZHAOYuling,ZHAOXudong,XUBianli,ZHANGHongwei

ParasiteDiseaseInstitute,CenterforDiseaseControlandPreventionofHenanProvince,Zhengzhou450016

Henan;Plasmodiumvivax;circumsporozoite protein;genotype

Aim:To explore circumsporozoite protein(CSP) genotypes structure ofPlasmodiumvivax(P.vivax) in Henan.Methods:Blood samples of 34 malaria patients from Henan Province in 2011 were collected to extract DNA,and amplified using nested PCR technique, and the product was sequenced and analyzed. Results:The results showed that the 24 specimens from Henan indigenous cases all belonged to PV-Ⅰ; amino acid homology analysis showed that the specimens could be divided into two genotypes: A and B, the sequence of type A showed 90.6%-94.2% homology to VK210, while type B showed 71.6%. Conclusion: TheP.vivaxCSP genotype of Henan all belongs to PV-Ⅰ, and it can be further divided into two genotypes, which is significantly different from other countries.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.004

*河南省科技攻关计划项目 092102310007

R382.3