睾酮对子宫内膜腺癌细胞LIF、HOXA10蛋白表达的影响*

管一春，杨雪峰，王兴玲，孙丽君，张彩霞，李巍巍，娄 华,李 丽

1)郑州大学第三附属医院生殖医学中心 郑州 450052 2)郑州大学第三附属医院妇产科 郑州 450052 3)郑州大学第三附属医院超声科 郑州 450052

睾酮对子宫内膜腺癌细胞LIF、HOXA10蛋白表达的影响*

管一春1)，杨雪峰2)#，王兴玲1)，孙丽君1)，张彩霞1)，李巍巍1)，娄 华1),李 丽3)

1)郑州大学第三附属医院生殖医学中心 郑州 450052 2)郑州大学第三附属医院妇产科 郑州 450052 3)郑州大学第三附属医院超声科 郑州 450052

#通讯作者，女，1956年5月生，教授，主任医师，研究方向：生殖内分泌及宫颈疾病，E-mail：yxfeng@zzu.edu.cn

多囊卵巢综合征；白血病抑制因子；同源框基因A10;Ishikawa细胞；睾酮

目的：探讨睾酮对子宫内膜腺癌Ishikawa细胞白血病抑制因子(LIF)和同源框基因(HOXA10)表达的影响。方法培养Ishikawa细胞，分别加入终浓度为0(对照)、10-8、10-6、10-4mol/L的睾酮溶液，采用免疫细胞化学法检测24和48 h后Ishikawa细胞LIF和HOXA10蛋白的表达。结果睾酮呈时间和浓度依赖性地性抑制Ishikawa细胞LIF和HOXA10的表达(LIF:F组间=19.205,F时间=32.745,F交互=37.379，P均<0.001。HOXA10:F组间=27.703，F时间=15.379，F交互=22.021，P均<0.001)。结论高雄激素血症可能是影响多囊卵巢综合征子宫内膜容受性的因素之一。

多囊卵巢综合征(polycysticovariansyndrome，PCOS)是目前排卵障碍性不孕症较为常见的原因之一，高雄激素血症(hyperandrogenemia,HA)是其最重要的特征之一。对PCOS患者采用促排卵等措施促使卵泡发育成熟并排卵后，其妊娠率仍徘徊在较低的水平，且流产率很高，提示可能还存在子宫内膜环境不良的因素。近年来关于子宫内膜容受性标记物的研究已经成为不孕症研究的焦点。白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)是子宫内膜容受性公认的标志物，常用于判断种植窗口期内膜允许胚泡黏附、植入的容受性。同源框基因(homeoboxgene，HOX)是一类转录调节因子。近年来研究[1-2]发现，HOXA10在子宫内膜的增生与分化、容受性建立、胚胎着床和子宫内膜蜕膜化等过程中不可或缺。被很多学者用作衡量子宫内膜容受性的标志物。研究[3]证实子宫内膜腺癌细胞Ishikawa细胞株是研究子宫内膜腺上皮细胞调节因素的良好模型。作者采用免疫细胞化学方法检测睾酮作用后Ishikawa细胞中LIF和HOXA10蛋白表达的变化，探讨PCOS患者子宫内膜容受性的影响因素，为进一步寻找促排卵治疗后不良妊娠结局的原因提供线索。

1 材料与方法

1.1细胞和主要试剂Ishikawa细胞由北京大学附属人民医院妇产科魏丽慧、王建六教授惠赠，属于贴附生长型细胞，来自人高分化子宫内膜腺癌组织，经分化培养可稳定传代，已证实该细胞株可以表达雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和睾酮受体(TR)。睾酮(粉剂)为美国Biologieal公司产品，羊抗人LIF和HOXA10多克隆抗体为美国SantaCruz公司产品，RPMI1640培养基为美国Gibco公司产品，免疫细胞化学SP试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术服务有限公司。

1.2细胞复苏、消化与培养Ishikawa细胞于液氮中储存，使用时随时复苏。将冻存细胞迅速放进37 ℃的温水中，并不停搅动，解冻后吸出细胞悬液放入15mL离心管中，500r/min离心6min,吸弃上清液，沉淀中加入4mL含体积分数10%小牛血清的完全培养液，于37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中培养。传5代后将旧培养液倒出后，加入Hanks液，轻轻吹打瓶壁上的细胞，加入消化液使其覆盖在整个细胞表面；显微镜下观察细胞变圆且其中间隙变大时，吸弃培养液，加入含体积分数10%小牛血清的完全培养液3～5mL；反复吹打细胞，混匀后制成细胞悬液；将其分装到3～5个培养瓶中，加入培养液5mL后密封，置37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。根据细胞生长情况更换培养基，一般更换频率为1 次/d; 细胞生长至70%～80%融合度时(一般2～3d)，丢弃培养基并用生理盐水洗2次，加入2.5g/L胰蛋白酶消化液消化。

1.3实验分组依据以上方法培养Ishikawa细胞，调整细胞密度为1×105mL-1，接种于24孔培养板(预先装有无菌盖玻片)中，分别加入终浓度为0(对照)、10-8、10-6、10-4mol/L的睾酮溶液[3]，每组设6个复孔，将细胞爬片(接种于24孔板的盖玻片)分别培养24和48h后取出。

1.4LIF和HOXA10蛋白的检测采用免疫细胞化学方法。将取出的细胞爬片置纯丙酮中固定30min。PBS清洗，体积分数5%牛血清白蛋白封闭。滴加稀释50倍的羊抗人LIF/HOXA10多克隆抗体;PBS清洗，滴加生物素标记的二抗;PBS清洗。DAB显色,苏木素复染,中性树胶封片。光镜下观察，LIF和HOXA10以细胞核和(或)细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞，以试剂公司提供的已知阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。选取5个高倍镜视野，使用Powersite显微图像采集系统分析，以阳性区的平均灰度值表示目的蛋白的相对表达量。

1.5统计学处理采用SPSS13.0进行分析。应用2×4析因设计的方差分析比较不同浓度睾酮作用不同时间后Ishikawa细胞中LIF和HOXA10蛋白表达的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

各组Ishikawa细胞中LIF和HOXA10蛋白的表达见图1和表1。

图1 各组Ishikawa细胞中LIF(1)和HOXA10(2)蛋白的表达(SP,×400)

A,B,C,D：作用24 h；E，F，G，H：作用48 h；A，E：0 mol/L睾酮；B，F：10-8mol/L睾酮；C，G：10-6mol/L睾酮；D，H：10-4mol/L睾酮。

表1 各组Ishikawa细胞中LIF和HOXA10蛋白的表达

LIF:F组间=19.205,P<0.001；F时间=32.745，P<0.001；F交互=37.379，P<0.001。HOXA10:F组间=27.703,P<0.001；F时间=15.379，P<0.001；F交互=22.021，P<0.001。

3 讨论

国内外众多学者认为，人体内正常范围内的雄激素在维持胚胎着床过程中子宫内膜微环境的稳定方面起着调节的作用[3]。PCOS患者异常的内分泌环境，不仅能影响卵泡的发育，对子宫内膜形态和功能也有一定的影响。并且高雄激素可以造成卵泡发育不良或者不排卵，致使黄体功能不全，进而降低妊娠率，增加流产的发生，还可直接影响子宫内膜的容受性。研究[4-5]表明雄激素通过雄激素受体(AR)产生过量的复合物，直接作用于子宫内膜，降低子宫内膜的容受性，进而影响妊娠结局。

Tuckerman等[6]认为雄烯二酮剂可影响内膜容受因子的分泌。文献[7-9]表明Ishikawa细胞是一种源自腺上皮分化良好的子宫内膜癌细胞，具有功能活性ER、PR和AR，是研究子宫内膜腺上皮细胞因子及其功能的理想模型。作者通过模拟PCOS患者高雄激素的内分泌状态，得出睾酮呈浓度和时间依赖性地抑制Ishikawa细胞中LIF和HOXA10的表达，进而影响子宫内膜的容受性。

总之，在临床上对PCOS不孕症患者的治疗中，仅仅通过促排卵药物促进卵泡生长，然后再通过药物诱导排卵的妊娠结局是不理想的。还需要采取措施改善内膜容受性。而降低体内雄激素水平，可能会改善子宫内膜容受性，改善促排卵治疗后妊娠结局。

[1]Taylor H.The role of HOX genes in human implantation[J]. Hum Reprod Update，2000，6(1)：75

[2]Chau MY,Pando S,Taylor H.HOXA11 silencing and endogenous HOXA11 antisense ribonucleic acid in the uterine endometrium[J].J Clin Endocrinol Metab,2002,87(6):2674

[3]魏兆莲,李美芝,陈咏健.高雄激素血症对子宫内膜功能的影响[J].中国妇产科临床杂志,2002,3(3):145

[4]Ito K,Suzuki T,Akahira J,et al.Expression of androgen receptor and 5 alpha-reductases in the human normal endometrium and its disorders[J].Int J Cancer,2002,99(5):652

[5]Okon MA,Laird SM,Tuckerman EM,et al.Serum androgen levels in women who have recurrent miscarriages and their correlation with markers of endometrial function[J].Fertil Steril,1998,69(4):682

[6]Tuckerman EM,Okon MA,Li T,et al.Do androgens have a direct effect on endometrial function?An in vitro study[J].Fertil Steril,2000,74(4):771

[7]Cermik D,Selam B,Taylor HS.Regulation of HOXA-10 expression by testosterone in vitro and in the endometrium of patients with polycystic ovary syndrome[J].J Clin Endocrinol Metab,2003,88(1):238

[8]Apparao KB,Lovely LP,Gui YT,et al.Elevated endometrial androgen receptor expression in women with polycystic ovarian syndrome[J].Biol Reprod,2002,66(2):297

[9]Zhou J,Shen K,Zeng JF,et al.Differential expression of microRNAs associated with estrogen receptor alpha and progesterone receptor in typeⅠ and typeⅡ endometrial adenocarcinomas[J].Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi,2009,44(10):765

(2013-10-09收稿 责任编辑李沛寰)

Effect of testosterone on expressions of leukemia inhibitor factor and Homeobox gene A10 in endometrial adenocarcinoma cell

GUANYichun1),YANGXuefeng2),WANGXingling1),SUNLijun1),ZHANGCaixia1),LIWeiwei1),LOUHua1),LILi3)

1)DepartmentofReproductionCenter,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofObstetricsandGynecology,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 3)DepartmentofUltrasonography,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

polycystic ovary syndrome；leukemia inhibitor factor；homeobox gene A10；Ishikawa cell;testosterone

Aim: To observe the effect of testosterone on expressions of the leukemia inhibitor factor(LIF) and homeobox gene(HOX) A10 in human endometrial adenocarcinoma cell line (Ishikawa). Methods: Ishikawa cells were treated with 0(control),10-8,10-6,10-4mol/L testosterone. After 24 and 48 h，the expressions of LIF and HOXA10 protein were detected by immunocytochemical technique. Results: Testosterone inhibited the expressions of LIF and HOXA10 in a time- and concentration- dependent manner(LIF:Fgroup=19.205，Ftime=32.745，Finteraction=37.379，allP<0.001;HOXA10：Fgroup=27.703,Ftime=15.379,Finteraction=22.021，allP<0.001).Conclusion:HyperandrogenemiamaycauselowendometrialreceptivityinpatientwithPCOS.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.022

*河南省卫生厅科技攻关项目 2011020054

R711.7