河南省肿瘤、慢性丙型肝炎、白癜风患者HLA-A2的分布*

王海楠，祁元明，高艳锋,周哲骏，李志勤，杜军波，李建斌，张 毅

1)郑州大学生物工程系 郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院生物治疗中心 郑州 450052 3)郑州大学第一附属医院感染科 郑州 450052 4)焦作煤业集团中央医院皮肤科 焦作454000 5)河南省红十字血液中心 郑州450053 6)郑州大学第一附属医院肿瘤科 郑州 450052 7)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052

河南省肿瘤、慢性丙型肝炎、白癜风患者HLA-A2的分布*

王海楠1,2)，祁元明1)#，高艳锋1),周哲骏1,2)，李志勤3)，杜军波4)，李建斌5)，张 毅1，2，6，7)#

1)郑州大学生物工程系 郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院生物治疗中心 郑州 450052 3)郑州大学第一附属医院感染科 郑州 450052 4)焦作煤业集团中央医院皮肤科 焦作454000 5)河南省红十字血液中心 郑州450053 6)郑州大学第一附属医院肿瘤科 郑州 450052 7)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052

#通讯作者：祁元明，女，1957年1月生，博士，教授，研究方向：抗原肽和多肽疫苗, E-mail：qymzzu@126.com；张毅，男，1964年4月生，博士，教授，研究方向：肿瘤免疫学、肿瘤干细胞和生物细胞治疗，E-mail：yizhang@zzu.edu.cn

HLA-A2；肿瘤；免疫治疗；慢性丙型肝炎；白癜风

目的：分析河南地区肿瘤、慢性丙型肝炎、白癜风患者HLA-A2的分布频率。方法应用流式细胞术和聚合酶链反应/序列特异性引物(PCR-SSP)技术检测分析了72例健康人(正常对照)和438例肿瘤患者、110例慢性丙型肝炎患者、97例白癜风患者外周血中HLA-A2抗原的分布频率。结果肿瘤、慢性丙型肝炎、白癜风患者中HLA-A2抗原的分布频率分别为49.1%、39.0%、47.4%，与正常对照组的48.6%比较，差异均无统计学意义(χ2=0.006,1.611,0.230,P均>0.05)。病例数超过50的肺癌(91例)、胃癌(56例)和食管癌(126例)患者中HLA-A2分布频率分别为42.9%、57.1%和38.0%，与正常对照比较，差异亦无统计学意义(χ2=0.537,0.919,2.081,P均>0.05)。结论河南肿瘤、慢性丙型肝炎及白癜风患者HLA-A2的分布无特异性，因此HLA-A2限制性的生物细胞免疫治疗具有广泛的应用价值。

肿瘤生物治疗主要包括细胞过继免疫治疗、细胞因子治疗、免疫基因治疗、肿瘤疫苗和单克隆抗体技术, 其单独应用或与手术、放疗、化疗联合应用均已经取得了令人瞩目的临床效果[1]。肿瘤生物治疗的主要免疫学机制之一是肿瘤抗原肽段通过HLA呈递在肿瘤细胞表面被T淋巴细胞识别，然后诱发肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes， CTL)反应。 抗原肽段、HLA以及T淋巴细胞之间存在着特异性的相互作用，也就是限制性。 目前绝大多数临床试验中使用的肿瘤疫苗或过继转移T细胞的疗法都是基于HLA-A2呈递的肿瘤抗原肽段诱导的CTL反应[2-3]。作者探讨了HLA-A2在河南地区不同人群中的分布，为HLA-A2限制性抗原在特异性生物细胞治疗中的应用奠定基础。

1 对象与方法

1.1研究对象收集2011年7月至2012年7月在郑州大学第一附属医院接受治疗的438例肿瘤患者(男198例，女240例，年龄55～73岁)、110例慢性丙型肝炎患者(男62例，女48例，年龄30～70岁)和97例白癜风患者(男51例，女46例，年龄50～70岁)。正常对照来自于同期在河南省红十字血液中心献血的献血员，共72人，男38人，女34人，年龄32～55岁。取肝素钠抗凝的外周血，用人淋巴细胞分离液(上海华精生物有限公司)密度梯度法分离，2 500 r/min离心25 min，分离获取外周血单个核细胞(PBMCs)。

1.2HLA-A2表型的PCR-SSP法检测HLA-A2位点特异性引物[1]由上海生工生物工程有限公司合成。第一对引物序列：上游5’-GCGCCGTG GAAGAGGGTCG-3’，下游5’-CCCGTCCCAATACTC CCGA-3’，扩增A基因5’端的236 bp。第二对引物序列：上游5’-GGTCCGGAGTATTGGGACG-3’，下游5’-GTGCTTGGTGGTCTGAGCT-3’，扩增A基因3’端的511 bp。用DNA提取试剂盒提取PBMCs DNA，提取的DNA样本1.8≤A(260 nm)/A(280 nm)≤2.0，纯度满足后续实验要求。以提取的DNA为模板，分别用两对引物进行平行扩增。PCR反应体系：基因组DNA 0.5 μL，引物25 pmol，PCR-mix 10 μL，用ddH2O补足总体系至20 μL。反应条件:94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循环30次;72 ℃延伸5 min。产物经琼脂糖凝胶电泳分析。

1.3HLA-A2表型的流式细胞法检测将每位受检者的PBMCs平均分为两份，分别置于样品管和对照管，细胞离心弃上清后，在样品管中加入2 μL anti-HLA-A2-PE、anti-CD3-FITC抗体，在对照管中加入2 μL anti-IgG-PE、anti-IgG-FITC抗体(抗体均为BD pharmingen公司产品)，避光孵育15 min,加入PBS重悬，洗去未结合的抗体，加入500 μL PBS重悬，上流式细胞仪(BD FACS Canto Ⅱ)检测。

1.4统计学处理应用 SPSS 10.0进行统计学分析。基因频率的计算采用直接计数法，两样本率的比较采用χ2检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1PCR-SSP和流式细胞法检测结果的比较PCR-SSP电泳图见图1。采用流式细胞技术与PCR-SSP方法检测72例正常对照、438例肿瘤患者、110例慢性丙型肝炎患者和97例白癜风患者HLA-A2的分布频率，结果一致。

图1 HLA-A2 PCR-SSP 分型电泳图

2.2不同疾病患者HLA-A2抗原的分布正常对照、肿瘤患者、慢性丙型肝炎患者、白癜风患者HLA-A2抗原的分布频率分别为48.6%、49.1%、39.0%、47.4%。肿瘤患者、慢性丙型肝炎患者、白癜风患者HLA-A2分布频率分别与正常对照比较，差异均无统计学意义(χ2=0.006,1.611和0.230,P>0.05)。

2.3不同肿瘤患者HLA-A2抗原的分布438例肿瘤患者中，肺癌(91例)、肾癌(56例)和食管癌(126例)病例数均超过50，这3种肿瘤患者中HLA-A2抗原的分布频率分别为42.9%、57.1%和38.0%，与正常对照比较，差异均无统计学意义(χ2=0.537,0.919和2.081,P>0.05)。

3 讨论

在免疫治疗中，具有HLA限制性的CTL反应在抗肿瘤免疫和机体抗感染(如丙型肝炎)、移植排斥反应以及某些自身免疫疾病(如白癜风)等过程中发挥关键作用[4-5]。在肿瘤治疗方面，CTL被认为是抗肿瘤免疫反应中最有效的效应群体。由于T 细胞只能识别与HLA分子结合的抗原肽段, 因而个体的T 细胞免疫反应能力很大程度上取决于其所携带的HLA分子。HLA-A2作为人类中分布最广、表达最频繁的MHC-Ⅰ类分子，分析其表达状况，对于生物治疗的进一步临床应用具有很大意义。

HLA-A2是在人类中发现的最频繁的特异性HLA-A分子之一，其拥有最多的异构等位基因，至今至少检测到31个亚族。HLA-A2分子作为CTL识别的限制因子在亲子关系鉴定和抗特殊病毒感染以及抗肿瘤中发挥了重要作用[6-8]。HLA-A2分子在各种肿瘤中表达的减少或缺失提示其在肿瘤免疫监视与逃逸中发挥了重要作用[9]。HLA-A2在不同人群中的分布频率不同，如在49.7%的美洲原住民、49.6%的高加索人、46.9%的西班牙人、36.0%的亚洲太平洋岛民和34.6%的非洲裔美国人中表达[10]。HLA-A2也被发现在54.0%的中国人、42.4%的日本人、30.3%的非洲人[11]、26.0%的印度人和37.0%的新加坡华人[12]中表达。在肿瘤疫苗方面，MAGE、WT1、NY-ESO-1 等大批肿瘤抗原均为HLA-A2限制性抗原肽，均可在体内、外诱导特异性CTL反应，有效杀伤肿瘤细胞[2]，部分由这些抗原肽构成的疫苗已进入三期临床试验。在过继细胞免疫治疗方面能短时间内产生大量的CTL或基因改造的T细胞治疗已成为新的热点，绝大多数这些基因改造的T细胞治疗也都是基于HLA-A2限制性的抗原肽诱导的CTL反应[3]。

随着对疾病认识的不断加深，人们越来越重视免疫系统在疾病的发生、治疗中的作用。随着鉴定方法的发展，越来越多的证据显示HLA与多种疾病相关。李长秦等[13]证实HLA-A2抗原在HCV 感染供血员中的分布频率显著低于健康供血员。徐龙等[14]发现肾癌患者HLA-A2等位基因的表达高于正常人。作者比较了河南省病毒感染(丙型肝炎)、免疫疾病(白癜风)和癌症患者中HLA-A2的分布频率与正常对照的差异，结果显示差异均无统计学意义。因此，在临床上应用的HLA-A2限制性疫苗的设计更具广泛性。

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(2013-05-22收稿 责任编辑王 曼)

Frequencies of HLA-A2 among patients with tumors，chronic hepatitis C and vitiligo in Henan Province

WANGHainan1,2)，QIYuanming1)，GAOYanfeng1),ZHOUZhejun1,2)，LIZhiqin3)，DUJunbo4)，LIJianbin5)，ZHANGYi1,2,6,7)

1)DepartmentofBioengineering，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)BiotherapyCenter,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 3)DepartmentofInfectiousDisease,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 4)DepartmentofDermatology,CentralHospital,JiaozuoCoalGroup,Jiaozuo454000 5)HenanRedCrossBloodCenter，Zhengzhou450053 6)DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 7)InstituteofClinical-MedicineofHenanProvince,Zhengzhou450052

HLA-A2;tumor;immunotherapy;chronic hepatitis C;vitiligo

Aim: To investigate HLA-A2 frequencies in the patients either with cancer or chronic hepatitis C, or vitiligo in Henan Province.Methods: The frequencies of HLA-A2 in 72 healthy people, 438 patients with tumors, 110 patients with chronic hepatitis C, and 97 patients with vitiligo, were detected by flow cytometry and PCR sequence specific primer (PCR-SSP). Results: The frequencies of HLA-A2 in patients with tumors, chronic hepatitis C, and vitiligo were 49.1%, 39.0%, and 47.4%,respectively,which had no significant differences from that of 48.6% in the healthy people(χ2=0.006,1.611,0.230,P>0.05). The frequencies of HLA-A2 in patients with lung cancer(91 cases), gastric cancer(56 cases),and esophageal cancer(126 cases) were 42.9%,57.1% and 38.0%,which had no significant differences from that of the healthy people(χ2=0.537,0.919,2.081,P>0.05). Conclusion: HLA-A2 is widely expressed in Henan population and it is valuable of applying HLA-A2 restricted immunotherapy for Henan population.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.015

*国家自然科学基金资助项目 81171986，81271815；卫生部科研攻关基金资助项目 20110110001；河南省科技厅基础与前沿技术研究基金资助项目 112300410153，122300410155；河南省科技厅科技创新人才计划项目 124200510006；郑州大学第一附属医院院内创新团队基金资助项目

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