T7噬菌体尾蛋白P11的表达、纯化及鉴定

赵翠娇，宁保安，范献军，李桂敏，高志贤1，#

1)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001 2)军事医学科学院卫生学环境医学研究所 天津300050

T7噬菌体尾蛋白P11的表达、纯化及鉴定

赵翠娇1)，宁保安2)，范献军2)，李桂敏2)，高志贤1，2)#

1)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001 2)军事医学科学院卫生学环境医学研究所 天津300050

#通讯作者，男，1966年5月生，博士，研究员，研究方向：食品安全，E-mail：gaozhx@163.com

T7噬菌体；P11蛋白；多克隆抗体

目的：表达、纯化T7噬菌体尾蛋白P11并进行鉴定。方法PCR扩增T7噬菌体尾蛋白P11基因片段，EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后连接表达载体pTIG-TRX，重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，纯化目的蛋白，SDS-PAGE分析P11蛋白的相对分子质量大小，并多次免疫新西兰大白兔制备其多克隆抗体，Western blot鉴定蛋白活性。结果PCR扩增P11基因后，成功诱导表达了含6×His标签的P11蛋白，SDS-PAGE显示所表达蛋白的相对分子质量约为25 000，通过多次免疫获得了抗P11的多克隆抗体并对其纯化；制备的多克隆抗体能够识别T7噬菌体和P11蛋白，具有较高特异性。结论成功表达了P11蛋白并制备了其多克隆抗体，为T7噬菌体展示系统的应用奠定了基础。

T7噬菌体展示系统具有操作简便、复制周期短、容易培养、生长迅速、系统稳定、不需要分泌到周质或膜外而直接展示的优点，因此，T7噬菌体展示已发展为一种常见的展示系统，被广泛应用于筛选基因工程抗体[1-3]。T7噬菌体衣壳蛋白主要包括头蛋白P10A、P10B,颈圈蛋白P8，尾蛋白P11、P12和尾丝蛋白P17[4-5]。P11蛋白位于T7噬菌体的尾部。将制备的抗P11蛋白多克隆抗体应用于噬菌体ELISA筛查，可使得融合于P10的蛋白或多肽更加有效地展示。为了进一步开展T7噬菌体展示基因工程抗体的研究，作者采用原核表达系统表达P11蛋白并制备出高效价的多克隆抗体。

1 材料与方法

1.1主要试剂与实验动物模板T7 Select 10-3b、表达载体pTIG-TRX、克隆菌株E.coliDH5α、表达菌株BL21(DE3)由)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室实验室保存。质粒pMD18-T购自大连TaKaRa公司。T4 DNA连接酶、限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ购自Fermentas公司。胶回收试剂盒、质粒DNA提取试剂盒购自美国Omega公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。清洁级健康新西兰大白兔由军事医学科学院实验动物中心提供。

1.2重组克隆载体pMD18-T-P11的构建P11蛋白基因片段的特异性上游引物为5’-GCGGAAT TCTAAATGCGCTCATACGATATGAAC-3’，下游引物为5’-GCCCTCGAGGCGAGTCAGTAGACCAG-3’，以T7 Select 10-3b为模板，进行PCR扩增。反应体系共20 μL。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min，30 个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物并回收。回收后的目的基因片段末端加A后与克隆载体pMD18-T连接，而后将连接产物转入氯化钙法制备的大肠杆菌DH5α感受态，并接种到含有氨苄青霉素(0.1 g/L)的LB固体培养基，37 ℃温箱培养12～16 h，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素(0.1 g/L)的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜，分别进行菌落PCR和质粒双酶切鉴定阳性克隆子，双阳性克隆子送往北京Invitrogen公司测序。

1.3重组pTIG-TRX-P11表达载体的构建选择测序结果正确的菌株提取质粒，用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切出目的基因，15 g/L琼脂糖凝胶电泳酶切产物并回收，回收后的目的基因与经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的表达载体pTIG-TRX连接，连接产物转化氯化钙法制备的BL21(DE3)感受态，并接种到含有氨苄青霉素(0.1 g/L)的LB固体培养基，37 ℃温箱培养12～16 h，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素(0.1 g/L)的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜，分别进行菌落PCR和双酶切鉴定阳性克隆子。

1.4重组P11蛋白的表达及纯化阳性表达菌株过夜活化后以体积比1:100接种于含0.1 g/L氨苄青霉素的LB液体培养基，37 ℃振荡培养3 h至A600 nm约为0.6，加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.001 mol/L，30 ℃振荡培养5 h后收集菌体。用缓冲液A(0.02 mol/L PBS缓冲液，0.5 mol/L NaCl，pH 7.4)重悬菌体，超声破碎后离心收集上清并用3倍A液稀释，加载到A液预平衡的Ni亲和柱，上样完毕后用A液平衡，用含0.02 mmol/L咪唑的A液洗脱杂蛋白，再分别用含0.05、0.10 mmol/L咪唑的A液洗脱目的蛋白，经SDS-PAGE进行鉴定。纯化得到的P11蛋白经HitrapTMDesalting柱去除咪唑，-20 ℃保存。

1.5动物免疫取健康雌性新西兰大白兔3只，体重2.5 kg左右，免疫前1周于耳缘静脉采血留作阴性血清。第一次基础免疫取0.5 mg纯化后的P11蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，于家兔背部四点注射，每点注射1 mL，以后每隔2个星期进行1次基础免疫，剂量加倍且用弗氏不完全佐剂乳化，从第3次免疫开始，每次免疫后1周于家兔耳缘静脉采血，用间接ELISA测定血清效价情况。当效价不再上升，进行心脏取血，采血前3 d进行一次不加佐剂的翻倍剂量加强免疫。

1.6多克隆抗体的纯化及鉴定取抗血清用醋酸盐缓冲液(0.06 mol/L，pH 4.0)稀释4倍并调节pH至4.5，缓慢滴加辛酸[6]，4 ℃搅拌0.5 h后静置2 h，4 ℃离心20 min(10 000 r/min)收集上清，经0.45 μm滤膜过滤后加入PBS(0.1 mol/L)并调节pH至7.4，于冰水浴中边搅拌边缓慢加入等体积的饱和硫酸铵(pH 7.4)，使其成45%的饱和度，继续搅拌0.5 h而后静置2 h，4 ℃离心20 min(10 000 r/min)，沉淀溶于PBS，先用双蒸水透析1 h，再用PBS(0.01 mol/L)透析12 h，4 ℃离心10 min，上清即为纯化后所得多抗。抗体纯化效果通过SDS-PAGE进行测定，并根据其结果对加入的辛酸量进行调整，纯化得到的多克隆抗体的浓度通过BCA蛋白定量进行测定。采用Western blot方法鉴定多克隆抗体活性。纯化后的P11蛋白进行120 g/L SDS-PAGE分离，电转移至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉过夜封闭，纯化后多克隆抗体作为一抗(1:10 000稀释)，37 ℃孵育1 h，羊抗兔IgG作为二抗(1:2 000稀释)，37 ℃孵育1 h，ECL显色试剂进行显色，压胶片显影。

2 结果

2.1P11蛋白基因片段的扩增及重组克隆载体的鉴定经鉴定，pMD18-T-P11构建成功(图1)。

图1 重组克隆载体pMD18-T-P11的酶切鉴定

M：Marker；1：双酶切后的pMD18-T-P11；2：pMD18-T-P11。

2.2重组表达载体的鉴定菌落PCR和双酶切鉴定阳性克隆子结果见图2。

2.3重组P11蛋白的表达、纯化SDS-PAGE电泳结果显示，阳性菌株经IPTG诱、导纯化后，其细菌裂解液在约25 000出现高纯度的蛋白条带，与预期蛋白相对分子质量相符，见图3。

2.4多克隆抗体的纯化及鉴定见图4、5。经条件优化，纯化出的多克隆抗体条带清晰(图4)，且经ELISA鉴定其结合活性没有受到影响。Western blot结果显示：在相对分子质量为25 000处T7噬菌体蛋白和6×His-P11蛋白有一条明显的条带，而空质粒即pTIG-TRX菌株诱导蛋白则无此反应(图5)。

图2 重组克隆载体pTIG-TRX-P11的酶切鉴定

M：Marker；1：双酶切后的PTIG-TRX-P11；2：未酶切的PTIG-TRX-P11。

图3 重组P11蛋白的纯化

M：Marker；1～3：含0.02 mol/L咪唑的A液洗脱所得样品；4～6：含0.05 mol/L咪唑的A液洗脱所得样品；7、8：含0.1 mol/L咪唑的A液洗脱所得样品；9、10：含0.5 mol/L咪唑的A液洗脱所得样品。

图4 抗P11蛋白多克隆抗体的纯化

图5 纯化后多克隆抗体的Western blot鉴定

1：含空质粒即pTIG-TRX的菌株诱导表达破碎后上清；2：P11蛋白；3：T7噬菌体。

3 讨论

T7噬菌体展示系统能够较完好地保持所展示蛋白的构象，所筛选出的结合蛋白与其自然状态较为接近[7]，与M13噬菌体系统所展示的蛋白相比，具有更好的多样性，因此T7噬菌体展示系统在一定程度上弥补了丝状噬菌体的不足[8]，近几年在抗体筛选中应用越来越广泛。

为了开展T7噬菌体展示筛选基因工程抗体的研究，一种高质量纯化的P11蛋白和高效的抗体对于后续的ELISA筛查是必不可少的。为了促进P11蛋白的高效表达，该实验构建了原核表达载体pTIG-TRX，此表达载体是由pET-22b改造而来，即在pET-22b内部插入一段TRX的基因序列，使其能够与目的基因进行共表达。TRX即硫氧还蛋白，它是一种相对分子质量为12 000的氧化还原蛋白，普遍存在于生物体内，其作为原核生物的组成蛋白，虽不属于分子伴侣的范畴，但具有与分子伴侣类似的功能，从而促进包涵体的可溶表达[9]。

该研究构建了6×His标记的T7噬菌体尾蛋白P11原核表达载体PTIG-TRX-P11，鉴定其序列正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达。利用6×His标签和镍离子特异性螯合的特性纯化，得到高纯度的目的蛋白。以纯化的P11蛋白为免疫原免疫新西兰大白兔成功获得了抗P11蛋白的多克隆抗体，为后续的T7噬菌体展示筛选基因工程抗体奠定了基础。

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(2013-10-29收稿 责任编辑李沛寰)

Expression，purification and identification of T7 bacteriophage tail protein P11

ZHAOCuijiao1),NINGBao'an2)，FANXianjun2),LIGuimin2),GAOZhixian1，2)1)DepartmentofNutritionandFoodHygiene,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

2)InstituteofHealth&EnvironmentMedicine,AcademyofMilitaryMedicalScience,Tianjin300050

T7 bacteriophage;P11 protein;polycolonal antibody

Aim: To express,purify and identify capsid tail protein P11 of T7 bacteriophage. Methods: Gene of protein P11 was amplified by PCR , digested with restriction endonucleaseEcoRⅠandXhoⅠand then inserted into the expression vector pTIG-TRX.The recombinant vector was transformed toE.coliBL21(DE3).After IPTG induction,the recombinant protein was purified by metal chelate chromatography.Its molecular weight was identified by SDS-PAGE and its activity was analysed by Western blot.The recombinant protein P11 was used to immune rabbit. Finally,the rabbit polycolonal antibody against protein P11 were obtained. Results: Gene of protein P11 was amplified by PCR.The recombinant protein P11 with 6×His tag has been successfully expressed after induction. SDS-PAGE analysis suggested that the molecular weight of the expressed protein was approximately 25 000. Western blot analysis suggested that the polycolonal antibodidy could recognize T7 phage and P11.Conclusion: We have purified P11 fusion protein and prepared the rabbit polycolonal antibody against protein P11 successfully,which lays foundation for the application of T7 phage display.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.017

R392.11