食管鳞状细胞癌组织中USP22、C-myc和Caspase-3蛋白的表达

郭艳丽，李颖霞，陈奎生，李晟磊，温洪涛#

1)郑州大学第一附属医院消化内科 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院病理科 郑州 450052

食管鳞状细胞癌组织中USP22、C-myc和Caspase-3蛋白的表达

郭艳丽1)，李颖霞1)，陈奎生2)，李晟磊2)，温洪涛1)#

1)郑州大学第一附属医院消化内科 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院病理科 郑州 450052

#通讯作者，男，1968年2月生，博士，教授，研究方向：消化道肿瘤，E-mail：wenhongtao68@163.com

特异性泛素肽酶22；C-myc；Caspase-3；食管鳞状细胞癌

目的：探讨特异性泛素肽酶22(USP22)、C-myc和Caspase-3蛋白在食管鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义。方法采用免疫组化SP法检测45例食管鳞状细胞癌组织、癌旁不典型增生组织及正常食管组织中USP22、C-myc和Caspase-3蛋白的表达，分析三者与食管鳞状细胞癌临床病理学特征的关系。结果食管鳞状细胞癌、癌旁不典型增生和正常食管组织中USP22、C-myc、Caspase-3蛋白的阳性表达率比较差异具有统计学意义(χ2=39.614、41.838和33.889，P<0.001)。食管鳞状细胞癌组织中USP22、C-myc蛋白的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、分化程度及临床分期有关(P<0.05)，Caspase-3蛋白的表达与肿瘤分化程度有关(P<0.05)；USP22蛋白与C-myc蛋白表达呈正关联(rP=0.559,P<0.001)，两者与Caspase-3蛋白表达呈负关联(rP=-0.468和-0.477,P<0.001)。结论USP22、C-myc高表达和Caspase-3低表达可能与食管癌发生发展相关。

食管癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，以鳞状细胞癌多见，其发生是多阶段、多因素、多基因共同作用的结果，研究其发病机制对食管癌的诊断及治疗意义重大。特异性泛素肽酶22(ubiquitin-specific processingpeptidase 22，USP22)是一种去泛素化酶，也是新鉴定的肿瘤干细胞标志物之一，其在多种恶性肿瘤细胞中普遍高表达，但在食管癌组织中的表达情况国内尚无报告。C-myc是肿瘤干细胞因子相关信号传导wnt通路重要成员之一，研究[1]表明其与USP22具有协同作用。Caspase-3作为细胞凋亡的最终执行者，其活化标志着凋亡进入不可逆阶段[2]。该研究通过免疫组化方法检测USP22、C-myc、Caspase-3蛋白在食管鳞状细胞癌(食管鳞癌)组织中的表达，探讨其在食管癌发生发展中的作用，为临床诊治及预后判断提供理论依据。

1 材料与方法

1.1标本来源选取郑州大学第一附属医院2011年1月至12月手术切除的食管鳞癌组织标本45例，其中男28例，女17例；年龄 45～82岁，<60岁23例，≥60岁22例；高、中分化27例，低分化18例；全层浸润(突破肌层至外膜)24例,未全层浸润(未突破肌层)21例；有淋巴结转移25例，无淋巴结转移20例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期19例，Ⅲ、Ⅳ期26例。所有患者术前均未进行放化疗，临床资料完整。所有标本分别在癌组织、癌旁不典型增生组织(取自距离癌组织边缘5 cm以内)和正常食管黏膜组织(取自手术切缘或癌组织边缘5 cm以外)3个部位取材，甲醛固定，石蜡包埋、5 μm厚连续切片,均经HE染色病理诊断证实。

1.2USP22、C-myc、Caspase-3蛋白表达的检测采用免疫组化SP法。兔抗人USP22多克隆抗体(稀释150倍使用)购自Abcam公司，兔抗人C-myc(稀释150倍使用)和Caspase-3(稀释100倍使用)多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。详细步骤严格按SP试剂盒说明操作。试剂公司提供的已知阳性的乳腺组织作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3结果判定USP22及C-myc蛋白以细胞核内出现棕黄(褐)色颗粒为阳性染色 ，Caspase-3以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性染色。高倍镜下选取10个视野，每个视野至少计数100个细胞，分别对阳性细胞数及阳性细胞染色强度计分。阳性细胞数<5%为0分，6%～为1分，26%～为2分，51%～为3分，>75%为4分；阳性细胞染色强度：细胞无染色为0分，淡黄染色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。两项评分相乘，总分<1分为阴性(-)，≥1分为阳性(+)。

1.4统计学处理应用SPSS 17.0分析，3种组织中USP22、C-myc、Caspase-3蛋白表达的比较采用χ2检验；食管鳞癌组织中USP22与C-myc蛋白的表达，两者与Caspase-3蛋白表达的关联性采用Pearson等级相关分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3种组织中USP22、C-myc、Caspase-3蛋白的表达见图1和表1。可以看出，从正常组织、不典型增生组织到食管鳞癌组织，USP22、C-myc蛋白的表达依次增强，Caspase-3蛋白的表达逐渐降低。

图1 3种组织中USP22(1)、C-myc(2)和Caspase-3(3)蛋白的表达(SP，×40)

表1 不同食管组织中USP22、C-myc及Caspase-3蛋白的表达阳性例数(%)

各组间两两比较,P均<0.05。

2.2USP22、C-myc和Caspase-3蛋白表达与食管鳞癌临床病理特征的关系见表2。USP22、C-myc蛋白的表达与肿瘤浸润深度、分化程度、淋巴结转移、临床分期等有关，与患者年龄、性别等无关；Caspase-3蛋白的表达仅与肿瘤分化程度有关，与年龄、性别、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期等均无关。

表2 USP22、C-myc和Caspase-3蛋白的表达与食管鳞癌临床病理特征的关系 阳性例数(%)

续表2

2.3食管鳞癌组织中USP22、C-myc及Caspase-3蛋白表达的关联性USP22与C-myc表达呈正关联，两者均与Caspase-3表达呈负关联。见表3～5。

表3 食管鳞癌组织中USP22和C-myc蛋白表达的关联性 例

χ2=20.417，rP=0.559,P<0.001。

表4 食管鳞癌组织中USP22和Caspase-3蛋白表达的关联性 例

χ2=12.598，rP=-0.468,P<0.001。

表5 食管鳞癌组织中C-myc和Caspase-3蛋白表达的关联性 例

χ2=10.900，rP=-0.477,P<0.001。

3 讨论

食管癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一，作为食管癌的高发及高死亡区,我国每年因食管癌死亡的人数约为15万,约占全部恶性肿瘤死亡人数的1/4，早发现、早治疗对食管癌的预后意义重大[3]。随着科技的发展，肿瘤相关机制的研究日益清晰，分子靶向治疗亦在食管癌治疗中崭露头角。如何通过分子生物学手段，寻找易感基因，提高食管癌的早期诊断率及改善中晚期食管癌的治疗疗效已成为目前食管癌研究的主要方向。

原癌基因USP22 定位于17号染色体，是一种去泛素化肽酶，参与组蛋白去泛素化、乙酰化进而参与 hSAGA复合物所调节的基因转录与表达等[4]。其与BMI-1、Cyclin B1等11个基因一起被称为癌死亡标签，在肿瘤的形成、侵袭生长、转移及化疗耐药等方面具有明确作用，且发挥广泛的生理作用，如调节细胞生长发育、细胞周期、细胞信号转导等[5-6]，其异常表达与肿瘤细胞的增殖、侵袭转移和治疗、预后等密切相关。研究表明USP22可能参与C-myc、P53介导的下游靶基因转录。Zhang等[7]发现下调USP22，可抑制myc介导的靶基因JPO1、ODC、CAD、Cyclin D2和MTA1等的转录，而在沉默USP22后, P53调控的靶基因p21、PIG3 和PUMA的表达也下调。Atanassov等[8]研究发现，USP22通过对端粒 DNA 结合蛋白(TRF1)去泛素化作用调节端粒动态平衡。该研究结果显示：USP22蛋白在食管正常组织、癌旁不典型增生组织、癌组织中的阳性表达率逐渐升高，其表达与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、临床分期等有关。这与Li等[9]研究一致，提示USP22的过表达使肿瘤易于发生发展、侵袭、转移、复发，是评价肿瘤分级，判断预后的指标之一。

C-myc属于myc癌基因家族，是多条信号转导途径的下游靶点，其激活是肿瘤发生的起始事件之一。C-myc通过与Ras、Sis、Fos等偶联激活、抑制Cyclin E活性、激活hTERT表达等多种途径导致肿瘤形成；通过抑制P21、P27等抑癌基因可使肿瘤细胞增殖能力增强，更易发生侵袭转移。该研究发现，食管正常组织、癌旁不典型增生组织和食管鳞癌组织中C-myc的阳性表达率逐渐升高，其表达与肿瘤的浸润深度、分化程度、淋巴结转移、临床分期等相关。这一结论与Wang等[10]的研究一致，与Gomes等[11]的结果不一致，原因有待进一步研究。

Caspase-3是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点，其激活后产生激活型Caspase-3，能使众多与细胞周期、细胞结构及DNA修复等相关的蛋白或激酶失活，从而使细胞发生凋亡[12]，在死亡受体通路及线粒体通路等诱导的凋亡过程中扮演重要角色。肿瘤的形成与凋亡障碍密切相关，Caspase-3在肿瘤细胞中表达情况的研究成为肿瘤分子生物学研究的热点领域。Caspase-3活性可作为评价肿瘤治疗反应的生物标志物，探究增加或抑制Caspase-3活性的因素在肿瘤病因学及防治学研究方面具有重要作用。Jiang等[13]研究表明Caspase-3在中国食管癌高发区食管癌中表达升高，且与细胞分化程度、浸润深度及临床分期等相关。王克文等[14]研究表明食管癌组织中Caspase-3表达明显低于正常食管组织，表达程度与肿瘤的分化程度相关，与肿瘤的浸润深度等临床特征均无相关性，与该研究结论一致。亦有研究[15]表明食管癌中Caspase-3表达低于正常组织，且表达率与癌组织浸润程度、淋巴结转移等相关。这些结论差异很大，表明Caspase-3具体机制尚未完全清楚,需进一步研究。

周英妹等[16]研究发现USP22与C-myc存在密切关系,耗竭细胞的USP22可阻止C-myc工作,使其所致癌细胞的侵入性生长停止,C-myc激活的基因转录过程需要USP22,USP22是一个完整转录过程的控制者。该研究还发现，USP22与C-myc表达呈正相关，与Caspase-3表达呈负相关，前两者高表达标志着肿瘤预后不良，Caspase-3的活性则可以成为肿瘤治疗反应的预测信号。

综上所述，该实验通过研究三者在肿瘤细胞的表达及其关系，希望为食管癌诊断、治疗、预后判定等提供新的切入点。

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(2013-10-13收稿 责任编辑李沛寰)

Expressions of USP22,C-myc and Caspase-3 proteins in esophageal squamous carcinoma

GUOYanli1),LIYingxia1),CHENKuisheng2),LIShenglei2),WENHongtao1)

1)DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

2)DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

ubiquitin-specific processingpeptidase 22;C-myc;Caspase-3;esophageal squamous cell carcinoma

Aim: To investigate the expression and clinical significance of USP22, C-myc and Caspase-3 proteins in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC). Methods: SP method of immunohistochemical was used to examine the expressions of USP22,C-myc and Caspase-3 proteins in 45 cases of ESCC,the atypical hyperplasia and normal esophageal tissues. Results: The positive expression rates of USP22,C-myc and Caspase-3 proteins in 45 cases of ESCC were 60.00%,66.67%,31.11%, respectively. There were significant differences between ESCC,the atypical hyperplasia tissues and normal esophageal mucosa(χ2=39.614,41.838 and 33.889，P<0.001)；There was relationship in the expression intensity of USP22 ,C-myc proteins and the differentiation grade of carcinoma, invasion,lymph node metastasis and clinical stages(P<0.05),The expressive intensity of Caspase-3 protein was related with the differentiation grade of carcinoma merely(P<0.05)；The expression level of USP22 was positively correlated with that of C-myc(rP=0.559,P<0.001)，both of them was negatively correlated with that of Caspase-3(rP=-0.468 and -0.477,P<0.001). Conclusion: The high level of USP22 and low level of C-myc might be necessary in the development and evolution of ESCC.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.003

R735.1