DZNep对Eca109细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响*

王瑞莉，李庆华，张彦婷，毛丽红，蒋海丽，龚方华，王 静，1,#，关方霞#

1)郑州大学生命科学学院 郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院细胞生物学研究室 郑州 450052

DZNep对Eca109细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响*

1)郑州大学生命科学学院 郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院细胞生物学研究室 郑州 450052

#通讯作者：薛乐勋，男，1944年2月生，本科，教授，研究方向：肿瘤标志物与基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn；关方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干细胞与再生医学，E-mail:guanfangxia@126.com

DZNep；Eca109细胞；增殖；凋亡；迁移

目的：探讨DZNep处理食管鳞状细胞癌Eca109细胞后对其增殖、凋亡及迁移能力的影响。方法DZNep处理Eca109细胞48 h，以DMSO处理48 h的Eca109细胞作为对照。采用EdU荧光显微镜法检测细胞增殖率，流式细胞仪检测细胞凋亡率，Transwell小室检测细胞迁移数。结果DZNep处理后的Eca109细胞增殖率为(34.60±4.45)%，低于对照组的(42.37±4.64)%(t=3.625，P=0.002)；其细胞凋亡率为(16.27±3.70)%，高于对照组的(7.38±0.77)%(t=7.061，P<0.001)；迁移到下室的细胞数为(179±38)个，较对照组的(494±99)个少(t=8.912，P<0.001)。结论DZNep能够抑制Eca109细胞的增殖和迁移，促进其凋亡。

S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase, SAHH)是生物细胞中广泛存在的一种蛋白水解酶，也是甲基化通路中一个关键的限速酶。抑制SAHH将导致细胞内甲基化抑制物S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH)的堆积，从而对转甲基反应产生反馈性抑制作用[1]。由于蛋白质、脂质和核酸等生物分子的甲基化对于维持细胞的活性是必需的，而且一些细胞膜信号分子的翻译后加工也需要甲基化的参与，所以抑制SAHH可能影响这些重要分子的甲基化。鉴于SAHH在调节生物体转甲基化反应中的核心地位，它已被选择作为多种新药研发的重要潜在靶点，包括免疫抑制剂、抗病毒药、防治动脉粥样硬化和阿尔茨海默病药物。SAHH抑制剂全新的化学结构、良好的作用效果和独特的作用靶点已引起国内外研究者广泛的兴趣。3-deazaneplanocin A(DZNep)是最有效的SAHH抑制剂之一，它可以引起胞内SAH的积聚进而导致S-腺苷蛋氨酸依赖的赖氨酸甲基转移酶的活化被抑制，这对于设计抗病毒药物具有重要意义。据报道DZNep可以抑制乳癌细胞的增殖[2]，抑制非小细胞肺癌细胞的增殖[3]，可用于治疗肝癌、急性髓系白血病、多形性胶质细胞瘤、髓母细胞瘤等[4-7]。但其对食管鳞状细胞癌细胞的影响尚未见报道，且食管鳞状细胞癌的发生发展涉及多种抑癌基因及原癌基因[8]。为了探讨DZNep对食管鳞状细胞癌的作用，该研究以食管鳞状细胞癌细胞株Eca109为研究对象，采用DZNep处理Eca109细胞后检测细胞增殖、凋亡及迁移能力的变化，报道如下。

1 材料与方法

1.1材料食管鳞状细胞癌细胞株Eca109为郑州大学第一附属医院细胞生物学研究室保存，DZNep购自美国Sigma公司，RPMI 1640培养基和胰蛋白酶均购自美国HyClone公司，标准胎牛血清(FBS)购自天津灏洋生物制品有限公司。EdU细胞增殖检测试剂盒购自广州锐博生物有限公司，Transwell小室购自美国Corning公司，结晶紫染色液购自北京碧云天公司。

1.2细胞培养Eca109细胞使用含体积分数10% FBS的RPMI 1640培养基于37 ℃、体积分数5% CO2的条件下培养。细胞培养至对数生长期进行处理及后期实验。

1.3EdU荧光显微镜法检测细胞增殖收集对数生长期的Eca109细胞，以每孔1×105个细胞接种于96孔板中，当细胞达50%～60%融合时，更换新鲜培养基，每孔加入0.5 μL 5 μmol/L DZNep继续培养48 h。同时以相同剂量DMSO处理的Eca109细胞作为对照。用细胞培养基按体积比1 000:1的比例稀释EdU溶液，制备成50 μmol/L EdU培养基，每孔加入50 μL，置于37 ℃培养箱中孵育1 h，弃去培养基。用PBS清洗细胞2次，每次5 min。每孔加入50 μL细胞固定液(40 g/L多聚甲醛)，室温下孵育30 min，弃去固定液；每孔加入50 μL 2 g/L的甘氨酸溶液，脱色摇床孵育5 min，弃去甘氨酸；PBS清洗5 min，每孔加入100 μL渗透剂(含体积分数0.5% TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10 min，然后用PBS清洗5 min。每孔加入50 μL的Apollo®染色反应液，避光、室温下在脱色摇床孵育30 min，弃染色反应液；Apollo®染色反应液应现用现配，最好在30 min内用完。然后每孔加入100 μL渗透剂(含体积分数0.5% TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗3次，每次10 min，弃渗透剂。每孔加入100 μL甲醇清洗2次，每次5 min，然后用PBS清洗5 min。每孔加入50 μL Hoechst 33342反应液，避光、室温下脱色摇床孵育30 min，弃染色反应液；用PBS清洗3次后在荧光显微镜下观察，并用DP-BSW软件制作覆盖图。每组取3个400倍视野，计数EdU染色细胞(增殖的细胞)和Hoechst 33342染色细胞(总的细胞)，计算细胞增殖率：细胞增殖率=增殖的细胞数/细胞总数×100%。实验重复3次。

1.4细胞凋亡检测取对数生长期的Eca109细胞，DZNep组用DZNep处理，对照组用DMSO处理，48 h之后取5×105个已处理细胞，用无EDTA胰蛋白酶对细胞进行消化，PBS清洗，离心并弃掉上清，每管加100 μL的Binding buffer、5 μL Annexin V-FITC及 PI室温避光孵育20 min，随后采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次。

1.5细胞迁移能力检测消化处理后的细胞，用无血清培养基洗3次，调整细胞密度为1×106mL-1，制成单细胞悬液。用消毒过的镊子将Transwell小室(无基质胶，滤膜孔径8 μm)夹入24 孔细胞培养板中，在下室中加入500 μL 含体积分数5% FBS的培养基。将上述制备好的细胞悬液300 μL加入上室中。在细胞培养箱中培养12 h后，取出Transwell小室，用甲醇固定30 min。用PBS洗去小室残留的甲醇溶液，加入体积分数为1%的结晶紫，室温染色30 min。PBS清洗3遍，用棉签小心擦去上室内未迁移的细胞，光镜下观察并计数迁移到下室的细胞数。实验重复3次。

1.6统计学处理采用SPSS 17.0进行统计学分析，2组间细胞增殖率、细胞凋亡率及细胞迁移数的比较采用两独立样本的t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1DZNep抑制Eca109细胞增殖结果见图1、表1。DZNep组细胞增殖率低于对照组。

2.2DZNep促进Eca109细胞凋亡见表1。

图1 DZNep对Eca109细胞增殖能力的影响(×400)

表1 对照组及DZNep组细胞增殖率、细胞凋亡率、细胞迁移数比较

2.3DZNep抑制Eca109细胞迁移见图2、表1。

图2 DZNep对Eca109细胞迁移能力的影响(结晶紫染色，×400)

3 讨论

DZNep是SAHH抑制剂，抑制SAH水解生成同型半胱氨酸和腺苷，SAHH在所有生物系统的调控甲基稳态方面起关键作用[9]。而后细胞中SAH的积累导致上游甲硫氨酸代谢(生成SAH)受到抑制。甲硫氨酸代谢是各种依赖性的新陈代谢过程中关键的一步,因此，甲硫氨酸代谢的抑制导致细胞整体新陈代谢受到抑制[2]。在该研究中，作者采用SAHH抑制剂DZNep处理Eca109细胞，结果发现细胞增殖率明显下降，凋亡率明显升高，迁移至下室的细胞数明显减少，表明DZNep可抑制Eca109细胞的增殖和迁移，促进其凋亡。

综上所述，SAHH有望成为食管鳞状细胞癌诊断的分子标志物，也可能是食管鳞状细胞癌基因治疗的有效靶点。

[1]姜怡邓,马琳娜,刘学英,等.S-腺苷同型半胱氨酸水解酶在同型半胱氨酸致平滑肌细胞增殖中作用机制的研究[J].中国现代医学杂志,2011,21(20):2347

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[3]Kikuchi J,Takashina T,Kinoshita I,et al.Epigenetic therapy with 3-deazaneplanocin A, an inhibitor of the histone methyltransferase EZH2, inhibits growth of non-small cell lung cancer cells[J].Lung Cancer,2012,78(2):138

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[5]Fiskus W,Wang Y,Sreekumar A,et al.Combined epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A and the histone deacetylase inhibitor panobinostat against human AML cells[J].Blood,2009,114(13):2733

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[8]王峰,王留兴,何伟,等.Stathmin基因在食管鳞癌中的表达及生物学意义[J].南方医科大学学报,2010,30(7):1552

[9]Ouyang B,Fei Z,Joung JG,et al.Transcriptome profiling and methyl homeostasis of an Arabidopsis mutant deficient in S-adenosylhomocysteine hydrolase1(SAHH1)[J].Plant Mol Biol,2012,79(4/5):315

(2013-09-27收稿 责任编辑姜春霞)

Effects of DZNep on proliferation, apoptosis and migration of Eca109 cells

1)CollegeofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)LaboratoryforCellBiology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

DZNep; Eca109 cell; proliferation; apoptosis; migration

Aim: To investigate the effect of DZNep on the proliferation, apoptosis and migration of Eca109 cells. Methods: DZNep was added to the medium of Eca109 cells and then incubated for 48 h, meanwhile, DMSO was used as control. The proliferation rate of Eca109 cells was examined by EdU method, the cell apoptosis rate was detected by flow cytometry assay, and cell migration rate was measured using Transwell assay. Results: Eca109 cells treated with DZNep had a lower cell proliferation rate [(34.60±4.45)%] than that of control group [(42.37±4.64)%](t=3.625，P=0.002). Eca109 cells treated with DZNep had a higher cell apoptosis rate [(16.27±3.70)%] than that of control group [(7.38±0.77)%](t=7.061，P<0.001). Eca109 cells treated with DZNep had a lower cell migration number [(179±38) cells] than that of control group [(494±99) cells](t=8.912，P<0.001). Conclusion: DZNep could inhibit the proliferative and migratory ability of Eca109 cells and promote its apoptotic ability.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.002

*国家自然科学基金资助项目 30700140；科技部国际科技合作基金资助项目 2007DFA01240

R735.1