苗药组方雾化剂对染矽尘肺纤维化大鼠模型血清SOD、NO水平及肺组织细胞凋亡基因FasL表达的影响*

★ 黄高 何光志* 宋贵喜 王昆 刘霞 王文佳 杨长福

(1.贵阳中医学院 贵阳 550002；2.贵州省总队离职干部休养所 贵阳 550002)

矽肺(silicosis)是尘肺中最为严重的一种类型，通常由于长期吸入含有游离二氧化硅(SiO2)的粉尘所引起。如果空气中游离二氧化硅的含量越高，颗粒越小(1-4μm)，接触时间越长，越易发病，病情进展愈快，病变会越发严重。矽肺的主要病理改变是肺组织弥漫性纤维化，临床表现活动性呼吸困难、限制性通气障碍、弥散功能降低和低氧血症等。本病属中医学的“咳嗽”、“肺痿”、“肺胀”等范畴。本病病位在肺,本虚标实，本虚为肺虚津气失于濡养，标实则多为痰(热)瘀毒，同时与肝、脾关系密切。

到目前为止，中医、西医治疗矽肺患者的手段比较局限，而采用苗医药防治矽肺患者的报道很少。因此，本研究能够给临床防治矽肺提供新的思路与方法，通过对矽肺患者辩证论治，并结合贵州省名中医朱祝生教授治疗矽肺患者已取得的临床经验。苗药雾化剂由鼠曲草、岩壁菜、岩豇豆、枇杷树根、矮地茶、铁扫帚、吉祥草、折耳根、白果和黄芪组成，具有清肺止咳，祛湿化痰之功效；中药组方由半夏、茯苓、陈皮、桔梗、苏子、葶苈子、海浮石、黄芪、党参、丹参、当归、川芎、三七和甘草组成，具有化痰止咳，补虚化瘀之功效。通过对染矽尘大鼠肺纤维化肺动物模型进行实验动物血清的SOD、NO以及肺组织中FasL基因进行检测，探索苗药组方雾化剂对矽肺的影响。

1 材料与主要仪器

1.1 动物 清洁级SD大鼠，体重180-220g，雄性，购自重庆市中药研究所实验动物研究所(许可证号：SCXK(渝)2007-0006)。

1.2 与试剂 苗药组方雾化剂(贵阳中医学院药学院制备)；中药购于贵阳中医学院一附院；地塞米松磷酸钠注射液(贵州光正制药有限责任公司，1mL：5mg×10支，国药准字HS2020793)；二氧化硅结晶型标准品(美国Sigma公司)纯度99%,粒子直径在0.5-10μm间,其中80%在1-5μm间；DNA Marker DL2000和2×TaqPCR Master Mix(大连宝生物工程有限公司)；总RNA抽提试剂盒和逆转录试剂盒(GIBCOBRL公司产品)；超氧化物歧化酶(SOD)WST-1法测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号：A001-3)；一氧化氮(NO)测试盒(南京建成生物工程研究所，货号：A013-2)。

1.3 主要仪器 紫外分光光度计(美国Pharmacia Biotech)；低速离心机(LD4-2)，北京医用离心机厂；超生波雾化器(粤华WH-2000)；超低温冰箱(Thermo Scientific Revco PLUS新型 -86℃)；德国Hettich低温高速离心机；控温水浴摇床(美国FORMA)；超微量全波长酶标仪(美国Multisksn Go)；显微镜摄像CCD照相系统(日本DP73+standard1.6)。

2 方法

2.1 造模 按照《实验动物学教程》“矽肺模型造模”方法[1]，选用清洁级SD大鼠58只(造模过程中死亡7只)，随机分为对照组(生理盐水组)、染矽尘组(二氧化硅模型组)、治疗1组(糖皮质激素雾化组)、治疗2组(苗药组方雾化剂雾化组)及治疗3组(苗药组方雾化剂合中药组)。各组大鼠10%水合氯醛麻醉后，气管注入1mL各实验用液体，立即将大鼠头部抬起直至大鼠完全直立，令实验用液体在两肺均匀分布。对照组注入灭菌生理盐水，模型组和治疗组给予50mg/mL二氧化硅粉尘悬液。待造模成功后，在15L玻璃容器内(雾化时预留通气口)，治疗1组给予糖皮质激素5mg(生理盐水配)每天雾化15min(雾化量0.5mL/min)，治疗2组给予苗药组方雾化剂每天雾化40分钟(雾化量0.5mL/min)，治疗3组给予苗药组方雾化剂雾化每天40min(雾化量0.5mL/min)加中药灌胃，每周7次。对照组、模型组、治疗1、2组给予等体积的生理盐水灌胃，各组动物于造模成功后40d处死。

2.2 动物处理及标本采集 造模30d后，随机取模型组大鼠肺组织HE染色。治疗组治疗结束后，各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血离心3000r/min,15min取血清，同时取大鼠肺组织-80℃储藏备用。

2.3 SOD抑制率测试 将每组每份待测血清分别取20μL放入测定孔中，另取1例对照组血清20μL。放入测定空白孔中，在对照孔和对照空白孔中分别加入双蒸水20μL，然后在对照孔和测定孔中分别加入酶工作液20μL，在对照空白孔和测定空白孔中分别加入酶稀释液20μL，最后在各孔中分别加入底物应用液200μL，通过超微量全波长酶标仪检测每份血清的SOD抑制率。

2.4 NO含量测定 按照南京建成生物工程研究所提供的一氧化氮(NO)测试盒(货号：A013-2)说明书步骤，通过超微量全波长酶标仪检测每份血清NO含量。

2.5 RNA提取与RT-PCR检测 从-70℃超低温冰箱取出待检组织，采用RNA抽提试剂盒进行抽提肺组织的总RAN，在分光光度计上测量吸光度。以总RAN为模板，以Oligo(dT)18为引物进行反转录。根据根据FASL在GenBank登录序列(MMU06948)，采用引物设计软件设计引物：FASL-Forward：5-CTACCACCGCCATCACAACC-3；Reverse：5-GTTTAGGGGCTGGTTGTTGC-3,，扩增序列456bp;内参基因-Forward：5'-TGA ACG GGA AGC TCA CTG G-3'，Reverse：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGGA-3'，其扩增产物长度为307 bp。采用25μL反应体系，PCR反应体系为：2×TaqPCR Master Mix:12.5μL；cDNA产物：1.5μL；无菌水：9.5μL，上下游引物各0.75μL。采用PCR技术检测各组肺组织细胞凋亡基因FASL表达影响。扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，用Bio-RadQuantity One软件对电泳条带进行扫描和光密度分析。

2.6 统计学处理 所有结果均以均数标准差表示用SPSS21.0软件进行方差分析P﹤0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 模型症状观察 照模后，发现各造模大鼠呼吸急促，喘息明显，饮食下降，身体倦怠，精神萎靡，体重减轻。

3.2 模型组大鼠肺组织大体观察HE染色 正常对照组大鼠肺组织见图1。造模30天后，随机取大鼠肺组织肉眼观察发现模型大鼠双肺有针尖大小散在灰白色结节，触之有砂粒感。HE染色，光镜下可见模型组肺泡壁破坏，结构紊乱，肺泡腔扩大，间质内有大量炎细胞浸润、巨噬细胞增多,出现明显矽结节，结节由成纤维细胞、纤维细胞和胶原纤维组成，呈同心圆结构。见下图2。

图1 正常组大鼠肺组织(HE×200倍)

图2 染矽尘大鼠矽结节模型(HE×200倍)

3.3 血清SOD抑制率变化和NO含量变化 对照组血清中SOD抑制率明显高于染矽尘组(差异有统计学意义，P﹤0.05)。通过不同途径治疗后，治疗1、2和3组血清中SOD活力明显高于染矽尘组(差异有统计学意义，P﹤0.05)，各治疗组治疗效果相当。说明通过不同途径给药后，药物对染矽尘大鼠血清SOD抑制率有增强作用，苗药组方雾化剂对增加染矽尘大鼠血清SOD活力有一定效果。

染矽尘组血清中NO含量明显高于对照组(差异有统计学意义，P﹤0.05)。通过不同途径治疗后，染矽尘组血清中MDA含量明显高于治疗1、2和3组(差异有统计学意义，P﹤0.05)，治疗2、3组优于治疗1组。说明通过不同途径给药后，药物对降低染矽尘大鼠血清NO含量的作用，苗药组方雾化剂对减少染矽尘大鼠血清NO含量有一定效果。

表1 各组大鼠血清SOD抑制率和NO含量变化±s，n=10)

3.4 FasL基因表达检测 经过RT-PCR扩增FasL基因，与对照组肺组织比较，发现染矽尘组、治疗1组、治疗2组和治疗3组肺组织FasL-mRNA含量明显高于对照组(P﹤0.05)，染矽尘组肺组织FasL-mRNA含量明显高于其他各组(P﹤0.05)，治疗1组、治疗3组和治疗2组各组间肺组织FasL-mRNA含量存在差异有统计学意义(P﹤0.05)。结果提示通过不同途径给药后，中西药物对染矽尘大鼠肺组织FasL基因表达有抑制作用，但苗药组方雾化剂具有显著降低染矽尘大鼠肺组织FasL基因表达作用，结果见表2。

表2 各组大鼠肺组织FasLmRNA表达结果比较±s，n=10)

4 讨论

在矽肺的形成过程中，动物体内会产生大量的自由基，从而导致机体内氧化/抗氧化失衡，这种失衡是粉尘所致肺组织损伤的原因之一。SOD是体内清除氧自由基的重要酶，SOD抑制率水平越低反映机体自由基的清除能力越低。NO在生物体内是一种反应性极强的自由基，兼有第二信使和神经递质的作用，NO含量越高说明机体内自由基含量增多。本次研究发现，染矽尘组大鼠血清中SOD抑制率水平明显降低，NO含量明显增加，通过苗药组方雾化剂雾化治疗后，大鼠血清中SOD抑制率明显增加，NO含量明显下降，苗药组方雾化剂配合中药灌胃作用更明显。

FasL主要在被激活的T细胞和B细胞上表达[2]。它能诱发大鼠肺组织细胞凋亡，在多种肺疾病的发生和发展中起重要作用，表达量越高说明细胞凋亡越显著。本次研究中发现，染矽尘组大鼠肺组织FasL基因表达明显高于其他各组，通过苗药组方雾化剂雾化治疗后，大鼠肺组织FasL基因表达能明显下降，苗药组方雾化剂配合中药灌胃效果更好。

通过本项研究证明，激素对矽肺的治疗是有效的，但不能够大剂量长期使用，在预示实验过程中发现，按常规量雾化超过30天后雾化大鼠会食欲下降，食量减少，体重减轻，继续下去会很快死亡，因此本项实验治疗1组每次雾化的激素量都有所减少，苗药组方雾化剂在雾化过程中没有发生此类情况，并对矽肺的治疗有一定的效果，中药灌胃能增强苗药组方雾化剂的治疗效果，两者可以搭配使用。

[1]胡建华，姚明，崔淑芳.实验动物学教程[M].上海：上海科学技术出版社，2009：1.

[2]袁红.Fas/FasL与凋亡研究进展[J].国外医学-生理病理科学与临床分册，2000，20(1)：26-29.