草乌与瓜蒌、白及配伍对心肌细胞毒性与增毒机制研究*

★ 张凌 刘长安 李文宏 柳芳林 翟兴英 金晨 杨世林

(江西中医药大学药学院 江西 南昌 330004)

中药“十八反”是基于中药配伍理论药性相反或相制的代表性组合，是在特定生理状态-中药配伍-剂量-物质成分变化产生的毒效表征，反药组合配伍后致毒、增毒特点及其毒性表征是亟待解决的科学问题。草乌为毛茛科植物北乌头aconitum kusnezoffii Reichb的干燥块根，具有辛，苦，热，有大毒，主治祛风除湿，温经止痛，常用于风寒湿痹，关节疼痛，心腹冷痛等[1]，研究表明草乌中的双酯型生物碱对心脏具有明显毒害作用[2]。草乌在是“十八反”中“半蒌贝蔹及攻乌”有配伍禁忌关系，课题组在前期草乌、草乌与瓜蒌和草乌与白及配伍小鼠体内急性毒性试验发现，草乌与瓜蒌、白及配伍后有明显毒性增强的趋势，而对配伍后相关作用机制研究报道很少。体外细胞培养具有可以保持细胞结构和功能的特点，且能避免体内环境干扰等优势[3]。本实验选用体外心肌细胞培养方法研究草乌、草乌与瓜蒌和草乌与白及配伍后对心肌细胞毒性作用同时探讨增毒作用机制，为“十八反”中药配伍禁忌提供实验数据支撑。

1 材料

1.1 药材 草乌(批号120701)购自浙江中医药大学中药饮片有限公司；瓜蒌(批号210191)、白及(批号205291)均购自北京华邈中药技术开发中心。经江西中医药大学邓可众副教授鉴定，草乌为毛茛科植物北乌头AconitumkusnezoffiiReichb的干燥块根，瓜蒌为葫芦科植物TrichosantheskirilowiiMaxim的干燥成熟果实，白及为兰科植物Bletillastriata(Thunb.)reichb.f.的干燥块茎。

1.2 细胞株 大鼠心肌细胞H9c2(2-1)，购自中国科学院上海生命科学院细胞库。

1.3 试剂 胎牛血清(Gibco公司)；MTT粉末(sigma公司)；DMSO溶液(Solarbio公司)；乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；超微量Na+-K+-ATP酶测试盒(南京建成生物工程研究所)；Annein Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒(贝博生物有限公司)；

1.4 仪器 CO2孵化箱(SANYO公司)ELx800酶标仪(Biotek公司)；FC500流式细胞仪(Beckman Coulter公司)；D-37520高速离心机(Thermo公司)；AB104-N电子分析天平(梅特勒-托力多(上海)有限公司)；100级超净工作台(上海博讯实业医疗设备厂)；-80℃低温冰箱(Thermo公司)。

2 方法

2.1 心肌细胞培养方法的建立 在经过紫外照射30min的超净工作台中，将大鼠心肌细胞，吸除原培养液，用1mL胰酶，消化30s，加入3mL含10%胎牛血清的DMEM培养液中止消化，吹打细胞，使细胞从瓶壁洗脱下来，再将细胞悬液转移到新的培养瓶中，放置37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养，大约48h换一次培养液，等到细胞长满后，冻存，传代，为细胞实验准备。

2.2 细胞存活率测定 将心肌细胞悬液密度为1×105的细胞接种到96孔板上，设10组，每组6个复孔，置于37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养48h，换无血清的培养基12h后，分别加不同药物不同浓度的大鼠血清的9个组(草乌、草乌+瓜蒌、草乌+白及各3个大鼠血清浓度)，正常组加入等量的空白血清，作用60min后，每孔加20μLMTT(5mg/mL)，37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养4h，吸除各孔溶液，每孔加入150μLDMSO溶液，置摇床低速振荡10min，使沉淀物甲瓒充分溶解，在酶标仪波长490nm处测定各孔的OD值。

2.3 LDH测定 将心肌细胞悬液密度为1×105的细胞接种到96孔板上，设10组，每组6个复孔，置于37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养48h，换无血清的培养基12h后，分别加不同药物不同浓度的大鼠血清9个组(同上)，正常组加入等量的空白血清，作用60min后，取上清液按照试剂盒要求进行测定。

2.4 Na+-K+-ATP酶活性测定 将心肌细胞悬液接种到6孔板上，接种10组，置于37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养48h，换无血清的培养基12h后，加不同药物不同浓度的大鼠血清(同上)，正常组加空白血清，作用60min后，将细胞消化，离心，去除上清液，每管加入0.2～0.3mL生理盐水制备成107/cm3的细胞悬液，用匀浆器破碎，按照试剂盒要求进行测定。

2.5 Na+-K+-ATP酶含量测定 将心肌细胞悬液接种到6孔板中，接种10组，置于37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养48h，换无血清的培养基12h后，加不同药物不同浓度的大鼠血清(同上)，正常组加空白血清，作用60min后，用胰酶消化，离心，除去上清液，将收集好的细胞加入300～500μL热双蒸水，置于热水浴(90～100℃)中匀浆破碎，再将细胞悬液置于沸水中加热10min，取出涡旋混匀1min，按照试剂盒要求进行测定。

2.6 细胞凋亡率的测定 将心肌细胞悬液接种到6孔板中，置于37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养48h，换无血清的培养基12h后，加不同药物不同浓度的大鼠血清(同上)，正常组加入等量的空白血清，作用60min后，进行染色，立即用流式细胞仪进行检测。

3 结果

3.1 心肌细胞存活率测定结果 和对照组相比，不同浓度大鼠血清给药组的OD值均有明显降低，与同浓度单独草乌组比较，草乌与瓜蒌、白及配伍后OD值低于单独草乌组，说明配伍后毒性强于单独草乌组，在统计学上有显著性差异(P<0.05),见表1。

表1 不同浓度含药血清对心肌细胞活力的比较

注：和正常组相比，*P<0.05；和同浓度单独草乌组相比，ΔP<0.05。

表2 不同给药组与对照组对心肌细胞LDH的比较

注：和正常组相比，*P<0.05。

3.2 LDH测定结果 不同浓度大鼠血清给药组的LDH均有明显上升，和正常组相比，在统计学上有显著性差异(P<0.05)，见表2。

表3 不同给药组与正常组对心肌细胞Na+-K+-ATP活力的比较

注：和正常组相比，*P<0.05。

表4 不同给药组与对照组对心肌细胞Na+-K+-ATP酶含量的比较

注：和正常组相比，*P<0.05。

表5 细胞凋亡率的测定结果

注：和正常组相比，*P<0.05。

3.3 Na+-K+-ATP酶活性的测定结果 不同浓度大鼠血清给药组能明显抑制Na+-K+-ATP酶活性，和正常组相比，在统计学上有显著性差异(P<0.05)，见表3。

3.4 Na+-K+-ATP酶含量测定结果 给药各组中ATP酶浓度都出现不同程度的下降，与正常组相比，不同给药组的细胞中的ATP浓度有显著性差异(P<0.05)，见表4。

3.5 细胞凋亡率的测定结果 随着血清浓度的提高，给药组的细胞凋亡率明显升高，与正常组相比，8%，16%大鼠血清给药组细胞凋亡率有显著性差异(P<0.05)，见表5。

4 讨论

中药相反是指两种药物合用，可能产生毒性、副作用或疗效降低。“草乌反瓜蒌”、“草乌反白及”属中药十八反范畴,中医将其视为配伍禁忌。本研究从草乌类中毒报道中心动过缓为主要表现[4]，毒性主要靶器官心脏入手，观察心肌细胞存活率研究其对心肌细胞毒性大小，从细胞膜通透性，Na+-K+-ATP酶活性，ATP酶含量以及细胞凋亡率4个指标研究其增毒作用机制。实验结果表明，与正常组比较不同浓度含药血清对心肌细胞均有不同程度毒害作用，同浓度含药血清中，草乌与瓜蒌、草乌与白及配伍后，毒性强于草乌组，表明草乌与瓜蒌、白及配伍后毒性增加。从细胞外LDH含量上升，说明草乌与配伍组增大了细胞膜通透性，导致细胞内环境的紊乱；抑制心肌细胞Na+-K+-ATP酶活性、降低其含量，导致细胞功能系统异常，加速细胞的死亡，结果与文献[5]相似。此外，在凋亡率测定中，当血清浓度达到8%时，细胞凋亡率明显上升，表明达到一定阈值时，草乌及配伍组会诱导细胞自身凋亡，从而加速细胞死亡。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典·一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：220.

[2]侯敏，石文宏，盛惟，等.草乌不同炮制方法与急性毒性的相关性研究[J].中国民族医药杂志，2011，8(8)：30-31.

[3]王衍堂.生草乌水提液心脏毒性体内外试验研究[D].成都：四川大学，2007.

[4]郭见恩，樊金铭，等.生川乌配伍全瓜蒌对小鼠急性毒性的影响[J].承德医学院学报，2012,29(4)：349-351.

[5]尹航.川乌配伍瓜蒌药效学及毒性研究[D].长春：中医药大学，2011:1-3.