热敏灸对PCPA致失眠大鼠SOD、MDA的影响*

★ 肖爱娇 付勇 王河宝 康明非**

(1.江西中医药大学 江西 南昌 330004； 2.江西中医药大学附属医院针灸康复科 江西 南昌 330006)

失眠是睡眠障碍中最常见的一种类型，通常指患者对睡眠时间和(或)质量不满足并影响白天社会功能的一种主观体验[1,2]。随着生活节奏的加快，竞争压力的增大，睡眠障碍已经成为一个影响现代人健康的重要问题，并越来越成为威胁世界各国公众的一个突出问题。据世界卫生组织对14个国家15个地区的25 916名在基层医疗就诊的病人进行调查，发现27%的人有睡眠问题；美国的失眠发生率高达32%～50%，英国10%～14%，日本20%，法国30%，中国也在30%以上。目前临床上治疗失眠的西药多是一些镇静、安眠的精神药物，虽短期症状缓解明显，但长期服用会导致药物依赖性、嗜睡、乏力、步态不稳等不良反应[3]，最终影响神经系统功能。而中医疗法治疗失眠具有较好的效果。

艾灸法作为针灸疗法的重要组成部分，是借助艾草燃烧时发出的药力和红外线温热刺激，来熏灼特定的穴位，刺激组织以调和气血、疏通经络，从整体上调节脏腑功能，以达到治病防病、养生保健的目的。该疗法操作简便，疗效显著，无任何副作用，正日益受到患者的亲睐。临床研究观察到艾灸治疗失眠病人具有较好的效果[4,5]。而腧穴热敏化艾灸新疗法(即热敏灸疗法)的出现，则大幅度提高了艾灸临床疗效，改观了中国灸疗临床现状[6]。临床研究表明，热敏灸治疗多种疾病具有良好的疗效，其治疗失眠也取得了很好的疗效[7]。然而热敏灸如何治疗失眠的机理还不清楚。据报道，睡眠剥夺大鼠体内存在SOD活性、MDA含量的异常[8,9]。那么，热敏灸能否通过调节机体抗氧化能力达到改善睡眠的效果？为此，本研究采用腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA)制备失眠大鼠模型，采用行为观察法、分光光度法等研究热敏灸对大鼠行为活动、SOD活性和MDA含量的影响，了解热敏灸治疗失眠的效果，阐明热敏灸治疗失眠的作用机理，为热敏灸治疗睡眠障碍提供理论和实验依据，促进热敏灸在睡眠障碍防治中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与分组 SD大鼠32只，雄性，体质量200g左右，由南昌大学医学院动物科学部提供，适应性喂养1周后，采用随机数字表将大鼠分为正常对照组(A)，模型组(B)，艾灸组(C)，热敏灸组(D)，每组8只。正常对照组(A组)：腹腔注射生理盐水，1次/d，共2d。模型组(B)：腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA,300mg/kg)进行造模，1次/d，共2d。艾灸组(C)：同模型组，并艾灸“百会”穴，1次/d，15min/次，共5d。热敏灸组(D)：同模型组，并艾灸“百会”穴，1次/d，40min/次，共5d。

1.1.2 主要试剂 对氯苯丙氨酸(PCPA，美国sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白定量试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)。

1.1.3 主要仪器 EthoVision XT动物行为跟踪系统(荷兰Noldus公司)；Scientz-ⅡD型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，RT-6000酶标仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)；UV759S紫外——可见分光光度计(上海精密科学仪器厂)；HH-4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；HH·W21·420S数显电热恒温水温箱(上海跃进医疗器械有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 失眠大鼠模型制备 采用腹腔注射PCPA制备失眠大鼠模型，根据文献[10]报道进行操作，即对B、C、D组大鼠，将PCPA用弱碱性(pH 7～8)生理盐水配置成混悬液，按300mg/kg体质量进行腹腔注射，1次/d，连续注射2d。

1.2.2 艾灸取穴与方法 在大鼠失眠模型造成后次日，即腹腔注射PCPA后第3日，将C、D组大鼠的头部的毛发剪去，露出“百会”[11]，作为艾灸穴位。

艾灸方法：用直径0.4cm，长10cm的艾条(江西中医药大学附属医院制)，距穴位2cm左右温和灸大鼠，1次/ d， C组15min/次，D组40min/次，共5d。

1.2.3 大鼠行为学观察 在第一次腹腔注射PCPA 28～30h后，每日定时录制视频30min，共5d，观察各组大鼠活动情况。

1.2.4 大鼠空间学习记忆力测试 于艾灸治疗期间，采用Morris水迷宫测试大鼠的逃避潜伏期，2次/d，共5d。测试方法：将测试时间设置为60s，操作者分别从两个入水点将大鼠面向池壁放入水中，观察并实时记录大鼠在60s内找到并爬上平台所需的时间，即逃避潜伏期。大鼠如果在60s内仍未找到平台，则将其牵引至平台停留10s，引导其学习记忆，潜伏期记为60s。逃避潜伏期越短，学习记忆力越好。

1.2.5 大鼠血清、脑干SOD活性和MDA含量的测定 (1)血清标本收集。治疗结束后次日，大鼠用3%戊巴比妥钠(30～40mg/kg)腹腔注射麻醉后，抽取腹主动脉血5mL置于离心管，然后以3 000r/min的速度离心15min，收集血清。

(2)脑干标本收集。待抽取腹主动脉血后，断头取脑，在冰上分离脑干，称取重量后按照1∶9(g/mL)的比例加入生理盐水，制成10%匀浆液，2 000r/min离心10min，收集上清液。

上述标本SOD活性采用WST-1法，MDA含量采用TBA(硫代巴比妥酸)法进行测定。同时采用BCA法检测大鼠脑干蛋白质的浓度。所有步骤均严格按照试剂盒说明书进行操作。

2 结果

2.1 大鼠的行为学观察 适应期间，所有大鼠活动良好，警觉性好，进食饮水正常，昼夜节律正常。在第一次腹腔注射PCPA 28～30h后，B、C、D组大鼠出现昼夜节律消失，白天活动不停，整体观察与A组有明显不同，表明模型成功。而给予艾灸治疗后，热敏灸组大鼠昼夜节律有所好转，白天能较安静入睡，行为活动趋于正常。

2.2 热敏灸对失眠模型大鼠逃避潜伏期的影响 从表中可以看出，第1d测试，各组大鼠平均逃避潜伏期均比较接近，自第2～5d，各组大鼠平均逃避潜伏期迅速下降。此外还可看到，在2～5d测试中，模型组大鼠的逃避潜伏期基本上均长于正常组大鼠；与模型组相比，艾灸组与热敏灸组大鼠的逃避潜伏期基本上均短于模型组大鼠，尤其是热敏灸组大鼠第3d明显短于模型组大鼠(P﹤0.05)。结果见表1。

表1 热敏灸对失眠模型大鼠逃避潜伏期的影响

注：#P﹤0.05与模型组相比。

2.3 热敏灸对失眠模型大鼠血清SOD活性和MDA含量的影响 从表中可知，模型组大鼠血清SOD活性低于正常组(P﹤0.05)，MDA含量与正常组接近，SOD/MDA比值仍低于正常组；艾灸组SOD活性与模型组接近，MDA含量明显低于模型组(P﹤0.05)，SOD/MDA比值高于模型组，但差别无统计学意义；热敏灸组SOD活性高于模型组，MDA含量明显低于模型组(P﹤0.05)，SOD/MDA比值明显高于模型组，差别有统计学意义(P﹤0.05)。见表2。

表2 热敏灸对失眠模型大鼠血清SOD活性和MDA含量的影响

注：※P﹤0.05与正常组相比；#P﹤0.05与模型组相比。

2.4 热敏灸对失眠模型大鼠脑干SOD活性和MDA含量的影响 从表中可知，模型组大鼠脑干SOD活性低于正常组，MDA含量高于正常组，SOD/MDA比值低于正常组；艾灸组SOD活性与模型组接近，MDA含量明显低于模型组(P﹤0.05)，SOD/MDA比值明显高于模型组，差别有统计学意义(P﹤0.05)；热敏灸组SOD活性明显高于模型组(P﹤0.05)，MDA含量明显低于模型组(P﹤0.05)，SOD/MDA比值明显高于模型组，差别有统计学意义(P﹤0.05)。见表3。

表3 热敏灸对失眠模型大鼠脑干SOD活性和MDA含量的影响

注：※P﹤0.05与正常组相比；#P﹤0.05与模型组相比。

3 讨论

目前睡眠剥夺动物模型很多，包括：应激相关模型(如心理应激、物理应激、围产期应激等)、药理学模型(使用PCPA、腺苷、咖啡因、5-HT、多巴胺、前列腺素、神经肽类等)、疾病和病理生理异常模型(神经变性疾病、代谢紊乱、血压异常、老化、感染等)、遗传模型等。相对于睡眠剥夺的其他方法而言，腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA)致失眠模型较为常用。有证据证明5-HT是引发非快速动眼睡眠的重要神经递质，通过注射色氨酸羟化酶的抑制剂PCPA来达到造模目的，而且该方法操作简单易行，成功率高、可重复性强、具有可逆性，所致模型符合人类失眠的某些特点，现已成为较常用的失眠动物模型[12]。因此，本研究采用腹腔注射PCPA制备失眠大鼠模型。实验结果观察到，在第一次腹腔注射PCPA 28～30h后，模型组、艾灸组和热敏灸组大鼠，出现昼伏夜出节律消失，白天活动不停，总睡眠时间减少，整体观察与正常组明显不同，表明模型制备成功。

目前，临床研究已证明，热敏灸治疗失眠已取得了较好的疗效[7]。热敏灸，通俗地说就是在热敏化腧穴上进行艾灸。临床实践发现，人体腧穴存在敏化态与静息态两种功能态，当人体发生疾病时能使体表腧穴发生敏化，敏化的类型多种多样，而腧穴热敏化是经穴敏化的一种新类型，处在热敏态的腧穴对热刺激特别敏感，能耐受较长时间(多数30min以上)的热刺激并感到很舒适，且观察到这种反应随疾病的发生而产生，随病情的改善而减轻或消失[13]。而传统悬灸的灸量每次每穴一般从10min到15min，或者以局部皮肤潮红为度，往往达不到治疗个体化的最佳灸量。灸量即艾灸的每次有效作用剂量。艾灸剂量由艾灸强度、艾灸面积、艾灸时间三个因素组成，在前两个因素基本不变的情况下，艾灸剂量主要由艾灸时间所决定。本研究同时观察了艾灸15min(传统悬灸)和艾灸40min(热敏灸)对失眠的治疗效果，结果显示：给予艾灸治疗后，与模型组相比，艾灸组和热敏灸组，尤以热敏灸组大鼠昼夜节律有所好转；逃避潜伏期明显缩短。周红勤等[4]指出，对失眠疗效的判定，除依据睡眠的时间外，更重要的是患者在治疗后大脑功能的改善。治疗后，患者头脑清醒、反应迅速、思维敏捷，记忆、认知功能得到改善，即使是睡眠时间未延长，这种治疗也是有效的。因此，本研究结果提示，热敏灸具有缓解失眠症状、提高学习记忆力的作用，且疗效优于传统悬灸。然而，热敏灸治疗失眠的作用机理还不十分清楚。

据报道，失眠大鼠体内存在SOD活性、MDA含量的异常[8,9]。那么，热敏灸能否通过调整体内SOD活性和MDA含量而达到改善睡眠的效果？众所周知，SOD属于抗氧化酶，其作用主要是清除氧自由基。其实，氧自由基可以是细胞正常代谢的产物，也可由外源性因素产生。正常情况下，由于细胞内同时存在生成氧自由基的体系和拮抗其生成的抗氧化剂体系(包括抗氧化剂如维生素C、维生素E等和抗氧化酶如SOD等)，所以小量生成的氧自由基，会被SOD等细胞内外抗氧化剂清除。病理情况下(如失眠等)，氧自由基大量产生，消耗SOD等抗氧化酶，使抗氧化酶活性下降，清除自由基的能力降低，导致氧自由基积聚过多，继而攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，形成脂质过氧化物，如MDA、酮基等，损伤生物膜，进而使细胞死亡[14]。徐孝平等[9]观察到睡眠剥夺大鼠血清SOD活性降低、MDA含量增加，大鼠体重、饮食量、饮水量均降低，出现各种失眠症状；给予中药治疗后，血清SOD活性增加、MDA含量下降，各种失眠症状也随之改善。众所周知，脑干网状结构内存在具有上行唤醒作用的功能系统，也是中枢神经系统5-HT能神经元胞体所在的部位，该部位对睡眠及觉醒具有重要的影响。本研究同时观察了脑干和血清SOD活性和MDA含量，研究结果提示热敏灸可能通过提高体内SOD活性和(或)降低MDA含量而达到改善睡眠的效果。

综上所述，我们推测热敏灸可能通过艾灸穴位，调动机体内源性的抗病机制，通过调节机体的SOD活性和MDA含量，进而达到改善睡眠的作用。这也可能是热敏灸治疗失眠的作用机理之一。然而热敏灸能否通过调节脑干5-HT含量发挥其治疗作用还有待于将来进一步的研究。

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