粘质沙雷菌β-内酰胺类耐药基因研究

谢在海，朱元祺，李 莉，邓乃梅，苏维奇*

(1.龙口市人民医院 输血科，山东 龙口265000；2.青岛大学医学院附属医院 检验科，山东 青岛266002；3.青岛市市立医院 a.检验科;b.医院感染管理科， 山东 青岛266011)

粘质沙雷菌广泛存在于自然界的土壤、水、植物表面及食品中，由于该菌的毒力较低，以前被认为是非致病菌或机会致病菌。然而，近年来许多研究表明，该菌在机体免疫力降低、各种医疗处置以及生活环境不良的情况下，可引发感染和医院内感染[1]。感染部位遍及机体各个系统，可引起呼吸道感染、泌尿道感染、创伤感染等多种疾病。近年来粘质沙雷菌的检出率逐年增高，并且其耐药性也有逐步升高的趋势，在医院感染中占有重要地位[2,3]。粘质沙雷菌的耐药机制较为复杂，为调查该菌β-内酰胺类耐药基因的携带情况，我们对临床分离的287株粘质沙雷菌的耐药表型进行分析，并对135株多重耐药的粘质沙雷菌进行多种β-内酰胺类抗菌药物的耐药基因进行检测，以探讨其耐药机制，报告如下。

1 材料与方法

1.1菌株来源收集住院患者的痰液、创面分泌物、血液、尿液等各种感染性标本，按《全国临床检验操作规程》(第三版)进行细菌培养，采用Vitek2-Compact全自动微生物分析系统进行菌种鉴定，使用板型为GNI，选择粘质沙雷菌287株，同时对常用抗菌药物进行MIC测定，使用板型为GNS，药敏结果严格按照CLSI标准进行判读，选出多重耐药(同时对三类以上抗菌药物耐药)的粘质沙雷菌135株，质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922，铜绿假单胞菌 ATCC 27853，统计学方法，采用WHONET5.6软件进行统计分析。

1.2ESBLs检测

参照美国临床实验室标准化研究所(CLSI)2010年推荐的ESBLs确认试验标准[4]，在两组药敏纸片中，任一一组在加CA后抑菌圈直径与不加CA的抑菌圈直径≥5 mm时，判定为产ESBLs。

1.3三维试验法检测AmpC酶

1.3.1 AmpC酶表型筛选：根据2010年CLSI推荐的K-B标准[4]，采用头孢西丁(30 μɡ)纸片扩散法筛选耐药菌株，抑菌圈≤18 mm提示疑产AmpC酶菌株。

1.3.2 AmpC酶确认试验：采用改良酶提取物三维试验法进行AmpC酶确认试验，参考文献[5]进行。

1.4PCR模板提取挑取新鲜菌落少许置入100-200 μl纯水中，沸水浴20 min后，10 000 rpm离心5 min,吸取上清液，并用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度及纯度，合格后置于-20℃保存备用。

1.5耐药基因检测均为聚合酶链反应(PCR)法，15种β-内酰胺类抗菌药物的耐药相关PCR扩增引物序列见表1。

1.6PCR扩增基因PCR扩增反应体系为50 μl，其中2.5 μ/μl Taq 0.5 μl,10×buffer 5.0 μl,25 mmol/L MgCL 2.5 μl，DNA 5 μl,dNTP 0.5 μl,Primer 0.5 μl,双蒸水16.8 μl。反应条件94℃ 5 min，36℃ 5 min，72℃ 5min循环5次，94℃ 1 min，36℃ 1 min，72℃ 2 min循环30次，72℃延伸10 min。PCR反应产物在1.5%琼脂糖凝胶上100V电泳40min后使用凝胶成像系统观察DNA条带分布并对其基因型进行分析。

表1 各种PCR引物序列及扩增片段长度

2 结果

2.1药敏试验结果药敏结果显示，粘质沙雷菌对美罗培南、舒普深和亚胺培南的耐药率较低，而对氨苄西林、哌拉西林和头孢曲松等临床常用抗菌药物的耐药率较高，见表2。

2.2粘质沙雷菌的产酶情况在287株粘质沙雷菌中，共有32株产ESBLs，检出率为11.1%，产AmpC酶44株，检出率为15.3%，同时产ESBLs和AmpC酶细菌16株，占5.6%。

2.3耐药基因检测结果在135株多重耐药的粘质沙雷菌中，检出含CTX-M基因菌株91株，TEM基因25株，SHV基因19株，DHA基因48株，KPC基因10株，MOX基因3株， OXA基因1株，oprD2基因7株。

表2 287株粘质沙雷菌的药敏结果(%)

3 讨论

革兰阴性菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要原因有产β-内酰胺酶、外膜蛋白改变以及主动泵出机制等，而产β-内酰胺酶仍然是革兰阴性菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药最常见和最重要的原因，对粘质沙雷菌而言，最为常见的耐药机制是由质粒介导的获得性ESBLs的产生，其检出率可高达80%[3],本组资料中，在287株粘质沙雷菌中ESBLs的检出率为11.1%，明显低于扈会整[3]80%的检出率，存在差异的原因，可能是与不同医院间抗菌药物的应用种类以及菌种的选择不同有关。ESBLs的耐药基因型主要有CTX型、TEM型、SHV型等，在135株多重耐药菌的粘质沙雷菌中，检出含CTX-M基因菌株91株、TEM基因25株、SHV基因19株，说明本地区粘质沙雷菌ESBLs的耐药基因型主要为CTX型，占主导地位，该耐药基因的特点是对头孢噻肟的水解活性远高于头孢他啶，这也很好的解释了本组资料中，粘质沙雷菌对头孢噻肟的耐药率为64.8%，远高于头孢他啶的30.0%。

AmpC酶的过量产生是粘质沙雷菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的另一个常见原因。AmpC酶是由细菌染色体上ampC基因编码，并受ampD、ampR、ampE和ampG调节基因所调控[6]。按其产生的方式分为3类：诱导高产酶、持续高产酶和持续低产酶。诱导高产酶的产生往往与β-内酰胺类抗菌药物的存在有关，而持续高产酶则在有无β-内酰胺类抗菌药物存在的条件下均可持续高水平产生。由于持续高产AmpC酶大多由质粒介导，因而可导致耐药菌株的广泛传播。本研究AmpC酶的检出率为15.3%，与周田美[7]的12.2%较一致，高于杨海飞[8]的7.7%，低于赵虎[9]的33.3%，说明AmpC酶的检出在不同医院间存在较大差异。

本研究结果显示，同时产ESBLs和AmpC酶菌株16株，检出率为5.6%，这一结果说明粘质沙雷菌既能通过质粒介导产ESBLs，又能通过染色体介导(或质粒介导)产生AmpC酶对β-内酰胺类抗菌药物耐药。

革兰阴性杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药最主要的机制是产生碳青霉烯酶，以KPC酶为主，目前已发现的KPC型酶已有11种，分别从KPC-1型至KPC-11型[10]。本研究在19株耐亚胺培南的粘质沙雷菌中，有11株检出KPC-2型酶，说明本地区粘质沙雷菌对亚胺培南耐药的主要机制是产生KPC酶。另外，膜孔蛋白的改变也仅在亚胺培南耐药的粘质沙雷菌中发现，提示，膜孔蛋白的改变可能是粘质沙雷菌对亚胺培南耐药的另一个重要机制。

药敏结果显示，粘质沙雷菌对氨苄西林、头孢曲松、头孢吡肟、头孢噻肟、氨曲南、庆大霉素、环丙沙星以及哌拉西林等临床常用抗菌药物的耐药率较高，耐药率均大于60%，对亚胺培南、美罗培南、舒普深的耐药率较低，耐药率均小于10%。说明粘质沙雷菌多重耐药现象较为严重，应引起临床的高度重视。

综上所述，本地区粘质沙雷菌对β-内酰胺类抗菌药物的耐药机制包括产生各种β-内酰胺酶、膜孔蛋白改变等，其中主要以产生各种β-内酰胺酶为主要耐药机制，包括AmpC酶、ESBLs和碳青霉烯酶。本地区粘质沙雷菌β-内酰胺类耐药基因型主要为CTX-M型和DHA基因型。产β-内酰胺酶菌株的基因型复杂多样，并且存在较大的地区差异，因此，对临床分离菌株进行连续监测，不仅能更好的体现出产β-内酰胺酶菌株耐药基因的流行情况，而且对减少抗菌药物的选择压力以及防止耐药菌株的传播流行等方面均具有十分重要的意义。

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[6]Schmidtke A J,Hanson N D.Model system to evaluate the effect of ampD mutations On ampC-mediated beta-lactam resistance[J].Antimicrob Agents Chemother,2006,50(6):2030.

[7]周田美，董晓勤，俞云松，等.沙雷菌属耐药现状及β-内酰胺酶检测[J].中华医院感染学杂志，2005,15(1)：103.

[8]杨海飞，程 君，胡立芬，等.黏质沙雷菌中AmpC酶的检测及药敏率分析[J].安徽医学，2012,33(2)：129.

[9]赵 虎，涂 婉，蒙 杰，等.医院感染中革兰阴性杆菌AmpC β-内酰胺酶产酶率分析[J].检验医学，2009,24(10):721.

[10]胡付品，朱德妹.KPC型碳青霉烯酶研究进展[J].中国感染与化疗杂志，2011,11(1)：76.