神经生长因子对小鼠睾丸支持细胞生理状态影响初探

付璐璐，郑连文，徐耀宏,张静文，梁文君，高利伟，胡文宇，王春强

(1.吉林大学第二医院 妇产科生殖中心，吉林 长春130041；2.赤峰市医院，内蒙古 赤峰024000；3.吉林大学动物科学学院,吉林 长春130000；4.辽宁医学院，辽宁 锦州210700)

神经生长因子(NGF)是神经系统最重要的生物活性分子之一,在神经细胞的生长发育、神经系统正常功能的发挥等方面起着重要作用[1]。除作用于神经系统外,对心血管系统、免疫系统、生殖系统等也有影响，很早就有研究表明哺乳动物的睾丸、附睾、前列腺中有NGF及其受体存在[2]。NGF对哺乳动物生殖系统的影响是近年来的研究热点之一，本研究将NGF对小鼠支持细胞的作用进行初步探索，为进一步阐明NGF对雄性动物睾丸发育及精子发生过程的调控机制提供科学证据。

1 材料与方法

1.1材料一周龄小白鼠、胶原酶(0.5 mg/ml)、胰酶(0.5 mg/ml)、PBS(0.3 mg/ml)、混合酶消化液 (0.1% collagenase,0.4% hyaluronidase,0.08% Dnase I和0.03% trypsin inhibitor)、培养基、显微镜、滤网、镊子、剪刀、蒸馏水等。

1.2方法(1)2个睾丸去膜后，放入10 ml PBS中洗两次，沉底；(2)将曲细精管加入4 ml胶原酶(0.5 mg/ml)中， 80 转/min,33 ℃，10-15 min，沉底；(3)放入10 ml PBS中洗两次，加入4 ml胰酶(0.5 mg/ml)消化5-10 min，34℃不摇；(4)放入10 ml PBS中洗两次，用含4 ml trypsin inhibitor的PBS(0.3 mg/ml)洗一次.沉底(2 min)；(5)加入4 ml混合酶消化液(0.1% collagenase,0.4% hyaluronidase,0.08% Dnase I和0.03% trypsin inhibitor) 80 转/min,34℃，40 min；(6)离心500 rpm,4 min，放入3 ml PBS中洗两次；(7)低渗纯化SCs：1 ml PBS悬浮,加2.5 ml的1∶10稀释的PBS，共3.5 ml，颠倒混3次，离心500 rpm,4 min；(8)10 ml的DMEM/F12洗两次，10 ml重悬，计数后铺板；(9)支持细胞的形态学观察及HE染色；(10)油红O染色鉴定睾丸支持细胞；(11)置于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，并随时观察两个培养皿中细胞的生长情况。

2 结果

2.1HE染色结果显示支持细胞凸起较多，细胞核呈类圆形，核仁清晰，胞浆淡染，细胞质内可见大小不一的空泡。

2.2油红O染色显示HE染色后的空泡结构被油红染为橘黄色，大小不等，呈悬浮状态，其实质为脂质小滴，散落在支持细胞中(见图1)。

2.3 48小时后对照组体外培养的小鼠睾丸支持细胞未见明显生长，NGF组小鼠睾丸支持细胞3-4小时生长即可以贴壁，48小时候已经长满培养皿(见图2)。

图1 油红O鉴定支持细胞的纯度(×400)

图2 NGF组培养48小时后支持细胞(×100)

3 讨论

近年来，人们在神经营养素对雄性动物繁殖系统作用的研究上取得了一定的进展。其中， NGF 的作用研究的最早，也较为系统。人们最先在小鼠的睾丸中发现了片段长度分别为 1.3 kb和1.5 kb的NGF的两种转录产物。它们均存在于小鼠睾丸中的精母细胞和早期精原细胞中。如果把大鼠睾丸支持细胞、间质细胞和管周细胞分离培养数天后，仍可以在细胞中检测出有大量NGF的表达。因此，可以得出结论，上述3种细胞均可以表达并分泌NGF[3]。在新生小鼠睾丸内，NGF的高亲合力受体TrkA在生殖细胞中没有表达，但表达于睾丸间质细胞中[4]。此后，在小鼠和人睾丸中的报道中也发现了类似的结果[5]。说明NGF可以通过自分泌或旁分泌的方式影响哺乳动物睾丸的发育，进而影响精子的发生。关于NGF在睾丸中的作用途径，近年来，人们也进行了大量的研究。研究发现，生殖激素是调节NGF在哺乳动物睾丸功能发挥的关键。大鼠的垂体被摘除后，大鼠曲细精管中NGF受体TrkA 的表达量显著降低，有些细胞甚至不再表达TrkA，说明垂体分泌的促性腺激素可以通过抑制TrkA表达影响NGF的功能的发挥[6]。此外，通过向大鼠体内注射hCG12h后，睾丸细胞内的TrkA水平显著的提高。核糖核酸酶保护实验表明，TrkA的mRNA水平在VⅡ和VⅢ期的表达最高[7]；睾酮也能影响 TrkA 的表达。当睾丸间质细胞被破坏或雄激素受体被阻断后，TrkA 的 mRNA 水平显著的提高，然而，睾酮的处理却会抑制 TrkA的表达[6]。以上说明雄激素可以调节睾丸中 NGF/TrkA 的信号传递。4-甲基儿茶酚(4-methylcatechol,4-MC)是促进NGF合成的一种儿茶酚类衍生物。当用10 μg/kg的4-MC 连续处理成年大鼠10天后，可显著的提高血浆中NGF的水平，同时，能表达TrkA的组织中TrkA 的表达量都显著提高。在成年的大鼠中，精母细胞、精细胞和精子中均有TrkA的表达，但是从表达量来看，TrkA 主要表达于精母细胞中。若用 4-MC处理新出生的大鼠，TrkA 的表达规律则与成年大鼠不同[8]。此外，人们通过建立TrkA敲除小鼠模型进一步说明了NGF/TrkA系统在雄性生殖生理中发挥的重要作用。TrkA被敲除掉后，胚胎期的第14天(E14)小鼠的睾丸中的曲细精管数目显著的低于对照组。从组织学上也能看出睾丸的发育明显的滞后。到了胚胎期的第19天(E19)，TrkA敲除小鼠的睾丸曲细精管中的精原细胞的数目显著减少，且曲细精管中的凋亡细胞的比例要比正常小鼠中多10倍以上[9]。然而，由于TrkA敲除小鼠出生后不久就会死亡，所以无法利用该模型分析NGF/TrkA系统对小鼠精子发生的影响。但是可以通过生精细胞的体外培养模型对此进行研究。当用NGF连续处理生精细胞5天后，生精细胞体外培养系统中处于第二次减数分裂后期的精母细胞的比例会显著增加，而精细胞的数量显著减少。但是，若用TrkA的抑制剂K252a处理后，精细胞的数量显著增加[10]。在精子的发生过程中，间质细胞与支持细胞均在生殖细胞的成熟、分化和精子的生成中发挥重要作用[11]。因此，NGF 及其受体 TrkA 在睾丸中各种细胞的表达及分布，说明 NGF 有可能是通过旁分泌的方式影响着生精细胞的分化。当用NGF处理14天后，大鼠睾丸中的支持细胞特异的雄激素结合蛋白(androgen binding protein，ABP)可显著的提高，说明在睾丸发育过程中ABP的作用可能受到NGF的调节[12]。在体外培养体系中，用10ng/mL 的NGF处理12天，可提高睾丸支持细胞的存活率，而用BDNF、NT-3和NT-4处理则没有这种变化[13]。此外， NGF 还可以提高小鼠睾丸间质瘤细胞中类固醇激素的分泌[14]。本文实验结果表明48小时后对照组体外培养的小鼠睾丸支持细胞末见明显生长，NGF组小鼠睾丸支持细胞3-4小时生长即可以贴壁，48小时已经长满培养皿。可知NGF可能促进小鼠睾丸支持细胞的生长。近年随着人们对NGF的深入研究，发现其并不是神经系统所特有的分子蛋白，NGF及其受体广泛存在于全身各个系统，并且发挥作用。

近年来的研究还发现，NGF 和 TrkA 同样还存在于成熟的牛和人的精子中，并且在少弱精症(oligoasthenozoospermic)患者的精液中 NGF 蛋白的含量和精子中 TrkA 的 mRNA水平均很低[15]。在牛成熟精子中，NGF 主要位于精子的顶体帽，核和尾部。若用 NGF处理2 h可以显著的影响牛成熟精子瘦素及胰岛素的分泌，并影响精子的活率和凋亡[16]。同时，NGF 还可以通过 MAPK 信号通路影响仓鼠精子的顶体反应，且这个过程依赖于 NGF的浓度和处理的时间[15]。

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