电离辐射对昆明大鼠背部全厚皮瓣leptin表达影响的研究

陈一夫，王博蔚，张环环，刘志辉，刘春丽

(1.吉林大学口腔医院，吉林 长春130021；2.吉林大学第二医院 妇产科，吉林 长春130041)

Leptin既是脂肪细胞分泌的多效细胞因子，也是一种分泌型的蛋白质类激素，可以通过受体介导的信号途径发挥作用，也可通过自分泌和旁分泌方式直接作用于周围的组织器官发挥作用[1-3]。近年来leptin的研究热点是其对伤口促愈作用机制的研究，开放性伤口单独外用leptin能明显缩短伤口愈合时间(从原来的5-7 d缩短到3-4 d)。其主要机制为：参与伤口愈合早期的炎症反应；刺激内皮细胞分泌血管紧张素Ⅱ，促进愈合早期的血管收缩；促进Ⅰ胶原和Ⅱ胶原的合成；促进血管内皮细胞的增殖，刺激微血管形成，促进血管再生；促进角化细胞的有丝分裂，促进上皮愈合；诱导血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)-β1和纤维生长因子(FGF)-β等致转移因子的释放，通过细胞因子之间的相互作用促进伤口愈合[4-9]。

Leptin能促进单纯伤口加速愈合，但其对于放创复合伤的愈合是否具有促进作用目前尚未知。本研究在于揭示放创复合伤对皮瓣组织内leptin的表达影响，从而为运用leptin治疗放创复合伤愈合的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

昆明小鼠(购自吉林大学动物实验中心)，leptin兔抗小鼠多克隆抗体、leptin长型受体(Ob-Rb)兔抗小鼠多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，PV-9001免疫组化检测试剂盒(中杉金桥有限公司)，复合消化液、抗原修复液(武汉博士德公司)，DAB显色试剂盒 及DAB染色增强剂(中杉金桥有限公司)，0.01M的PBS(北京鼎国生物技术公司)。

1.2 方法

1.2.1 放创复合伤动物模型的建立 昆明小鼠，雄性，标准饲养一周后，用随机数字表随机分为4组：空白对照组(D)，创伤组(C)，放射组(F)，放射+创伤组(放创组)(FC)每组24只。水合氯醛腹腔注射麻醉，小鼠背部去毛，将(C)、(FC)组小鼠俯卧于手术台上，碘伏消毒，铺无菌巾，设计2.5 cm×2.0 cm全厚随意皮瓣，游离端位于髂棘之上1 cm，蒂设计在尾端，创缘各距背部中线两侧0.5 cm，眼科剪沿划线区剪开预备全厚皮瓣，沿创缘原位对位缝合创口。术后3天F及FC组采用电子线对小鼠进行局部照射，照射野为矩形，大小为3.5 cm×3.0 cm，照射野外围比较皮瓣面积外围均大出0.5 cm。采用瓦里安的电子直线加速器，电子线照射，5Gy。对实验小鼠每日进行大体观察，分别于放射后1 d，2 d，3 d处死各组小鼠8只，于皮瓣中轴线上距离蒂部1.5 cm，左右距中轴线0.5 cm处取随意皮瓣(面积为1.0 cm×1.0 cm)，立即投入4%的多聚甲醛固定常规脱水包埋，进行HE染色及免疫组化。

1.2.2 检测指标 (1)大体观察。 (2)HE染色，组织学观察。(3)免疫组化染色：石蜡切片进行常规脱蜡水化，对组织切片进行Leptin、Ob-Rb免疫组化的染色，操作步骤按照PV-9001免疫组化检测试剂盒所提供的进行。

2 结果

2.1 大体观察

(1)创口愈合情况：

各组皮瓣无溃疡坏死情况。同一时间，放创组的渗出较单纯创伤多，结痂面积较单纯创伤组大，皮肤质地较单纯创伤组硬。伤口愈合时间比较：单纯创伤组创口愈合时间大约为4 d-8 d，平均6 d；放创组为9 d-24 d，平均14 d。

(2)毛发再生情况(见图1)

毛发开始再生时间：空白组：1 d-2 d，平均1 d；单纯创伤组为2 d-5 d，平均3 d，单纯照射组为：6 d-32 d，平均均为8 d，放创组：9 d-30 d，平均12 d。

毛发完全恢复时间：空白对照组：2 d-5 d，平均4 d；单纯创伤组为7 d-14 d，平均9 d；单纯照射组为：12 d-40 d，平均18 d，放创组：12 d-40 d，平均25 d。

图1 毛发生长时间比较

2.2 组织病理学检查

单创组可见创伤后0 d-5 d大量炎症细胞浸润和创缘出血，随时间延长，炎症细胞数量减少，肉芽组织增生，上皮延伸，创口愈合。放创组可见：上皮层内细胞出现空泡化现象；有的上皮细胞出现异型性改变和基底膜消失；照射后3 d-7 d内，上皮钉突延长；7 d后上皮钉突变短或消失；伤口愈合后，上皮变薄，胶原纤维稀疏切排列紊乱。放射组：间质中可见少量炎性细胞浸润，主要是单核细胞，胶原纤维变性萎缩，玻璃样变，整个上皮层变薄(见图2)。

图2 放创组组织病理学变化

2.3 免疫组化结果

(1) 免疫组化观察：

Leptin在角化上皮细胞及毛囊根鞘中呈强阳性表达，在基底膜和成纤维细胞中呈弱阳性表达，在皮脂腺的混合性腺泡的浆液细胞呈强阳性表达。Ob-Rb在细胞团的外层角化细胞及上皮棘层细胞的细胞间桥中呈强阳性表达，在毛囊的根鞘的内外根鞘均呈强阳性表达，血管内皮细胞弱阳性表达，在皮脂腺的浆液性腺泡呈强阳性表达，粘液性腺泡不表达(见图3、4)。

图3 leptin在不同部位的表达情况

图4 OB-Rb在皮肤不同部位的表达

(2) 各组间leptin及OB-Rb表达的差异性比较：免疫组化灰度积分统计表明，电离辐射后早期(1-3天)，放创组leptin及其受体的表达明显增强，其表达量高于单纯创伤组、单纯放射组及对照组；而单纯创伤组的表达量明显强于单纯放射组及对照组；单纯放射组强于对照组(见表1、表2)。

表1 各组间leptin表达的比较

放射后第1、2、3天组间两两比较leptin的灰度积分，P<0.05具有统计学意义。创伤组，放射组，放创组各组内进行leptin灰度积分统计，P<0.05具有统计学意义。

表2 各组间OB-Rb表达的比较

放射后第1、2、3天组间两两比较OB-Rb的灰度积分，P<0.05具有统计学意义。创伤组，放射组，放创组各组内进行OB-Rb灰度积分统计，P<0.05具有统计学意义。

3 讨论

本研究发现黏液性腺泡细胞和肌上皮细胞对放射线不敏感，若损伤长期存在，浆液性腺泡细胞萎缩、消失，导管扩张，导管上皮出现鳞状细胞化生，间质纤维化，炎症细胞浸润和脂肪组织增生。真皮间质胶原呈不同程度水肿，胶原断裂，少量淋巴细胞浸润，胶原纤维裂解，出现玻璃样变，弹力纤维增多。据此我们推测浆液性腺泡是电离辐射的靶细胞。

有学者发现在皮肤创伤后早期OB-Rb表达量降低，第5天起表达水平迅速上调。免疫组化在位于伤口边缘表皮内角化细胞中检测到高表达的OB-Rb，体外实验也证实外源性的Leptin可显著促进小鼠或人原代角化细胞的增殖，而这种刺激效应能够被一种可溶性的无功能leptin受体所阻断[10]。本研究发现，无论是单创组、单纯放射组，还是放创组，在早期leptin及其受体的表达都显著上升，尤以放创组更为显著，这提示放创复合伤愈合早期，leptin以旁分泌或自分泌的方式参与创伤愈合。

本研究发现：在放创复合伤局部，Leptin在角化上皮细胞及毛囊根鞘中呈强阳性表达，在基底膜和成纤维细胞中呈弱阳性表达，在皮脂腺的混合性腺泡的浆液细胞呈强阳性表达。Ob-Rb在细胞团的外层角化细胞及上皮棘层细胞的细胞间桥中呈强阳性表达，在毛囊的根鞘的内外根鞘均呈强阳性表达，血管内皮细胞弱阳性表达，在皮脂腺的浆液性腺泡呈强阳性表达，粘液性腺泡不表达。该结果提示leptin可能参与调控毛囊的形态发生，且毛囊根鞘很可能是电离辐射作用的靶器官，电离辐射会导致毛囊根鞘的损伤，因此影响毛发再生，这与本研究结论完全相符，虽然电离辐射导致毛囊根鞘局部反馈性调节致使leptin及其受体表达显著提高，用以加速局部的创伤愈合，但是仍不足以弥补电离辐射所致毛囊根鞘局部创伤修复细胞的受损，因此会导致毛发再生延迟或减少。这与某些学者的研究结论相符，诸如毛囊等上皮结构的发生可能依赖于leptin的信号传递，后者通过激活细胞内的信号级联系统复合物的磷酸化完成[11-12]。

综上所述，电离辐射会导致放创复合伤局部早期Leptin及其受体的表达明显升高，尤以浆液性腺泡细胞及毛囊根鞘显著，提示浆液性腺泡细胞及毛囊根鞘作为电离辐射的靶细胞参与了放创复合伤的早期愈合，通过正反馈调节作用分泌Leptin促进放创复合伤愈合。

作者简介：陈一夫(1993-)，男，本科学历，研究方向：口腔颌面部创伤修复与重建。

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