深圳市妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E6、E7致癌基因的序列分析

关嵩青,林 莉,叶 菲

(深圳市第二人民医院 妇科，广东 深圳518035)

近年来众多各国学者对宫颈癌的病因以及宫颈鳞状上皮细胞发生癌变机制的分子流行病学研究资料表明，99.7%的宫颈癌的发生和发展过程与人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)，特别是与高危型人乳头瘤病毒(High-risk HPV,HR-HPV)的持续感染密切相关[1]，是宫颈癌的主要致癌因素。在目前所有已知的HR-HPV亚型中,感染率最高的是 HPV16型,约占58%。据文献报道,与其他的HPV亚型相比,HPV16 型更容易在宫颈鳞状上皮细胞内长期复制生存[2]，引起宫颈鳞状上皮内瘤样病变(Cervical intraepithelial neoplasia,CIN)[3]的可能性更大，它是通过致癌基因E6的原癌蛋白与p53相互作用,形成新的蛋白复合物,使p53降解、功能减弱甚至丧失,破坏p53介导的细胞对DNA 损伤的免疫应答，导致细胞周期紊乱,不断加重DNA 损伤,最终引起癌变[4]；另一方面通过致癌基因E7的原癌蛋白与视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)结合，激活细胞周期,引起组织细胞增殖[5]。由此可见，HR -HPV E6、E7基因都是早期致癌基因，它们二者在宫颈上皮细胞的表达在其癌变发生过程和维持恶变细胞恶性表型两方面都起着极其重要的作用。

为了解深圳市宫颈癌患者癌组织中HPV16型E6、E7致癌基因的结构特点,本研究对我院1 例在深圳市居住了17年、HPV16型感染的宫颈癌患者的手术标本进行了HPV16型 E6、E7致癌基因克隆及一级结构分析，探讨深圳市HPV16型地方株与德国标准株 E6、E7基因核苷酸序列的差异。

1 材料和方法

1.1 标本来源

来源于深圳市第二人民医院宫颈癌手术切除组织标本,组织病理诊断为宫颈鳞状细胞癌，按FIGO 分期为Ⅱb期,特异性PCR 分型确定为HPV16 型阳性。该患者40岁，至发病止在深圳居住生活17年。

1.2 HPV16型E6基因检测

1.2.1 设计、合成PCR引物 设计HPV PCR L1基因引物和HPV16型E6基因引物是参考GenBank的德国标准株中的序列，自行设计，引物序列如下：MY09:5′-GCCTMCRAGRAGAWTCAGCT-3′；MY11:5′-CGCMGAGGCWTAAAAYTAGG-3′；HPV16 E6上游:5′-AGTAGCTGCGTAAGAAATGA-3′；HPV16 E6下游:5′-TTTGTTACGGTTCGGATAC-3′。

1.2.2 PCR 扩增HPV16型 E6基因及HPV L1基因 提取本例宫颈癌患者手术切除标本癌细胞中的DNA，作为样板，在高保真Taq酶的作用下PCR扩增HPV L1基因，将PCR扩增所得产物2%琼脂糖凝胶电泳，电泳所测得的序列与Blast序列比对分型，挑选出HPV16型标本，再用HPV16型E6基因引物对其PCR扩增，挑选在500 bp附近处出现DNA带的标本，最后予以纯化。

1.2.3 检测序列 把前述已提纯的PCR产物在DNA自动序列分析仪(AB I3730型)上通过MY11、MY09引物的作用，用PCR直接测序法，对目标基因的正负双链从正反双方向同时测序，对突变标本则重新PCR扩增，反复测序，旨在防止PCR扩增过程产生的误差，导致实验数据不精确。应用同样方法对HPV16 E6基因的目标基因正、负链从正、反双方向予以测序。

1.2.4 HPV 16型 E6基因多态性分析 以Blast序列与前述测出的序列进行比对分型，应用DNAstar5.0和MEGA3.1软件分析HPV16型E6基因的多态性。

1.3 HPV16型 E7 基因测定

1.3.1 质粒和宿主菌 在Promega公司购买pGEM-Teasy载体，采用扬州大学比较医学中心提供宿主菌DH5α。

1.3.2 试剂 常规的分子生物学试剂如异丙基硫代-β-D-半乳糖苷( IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、限制性内切酶、Taq聚合酶等上海生物工程公司购买，在大连宝生物公司购买DNA Marker和T4DNA连接系统，在QIAgen公司购买凝胶回收试剂盒和DNA提取试剂盒

1.3.3 癌组织DNA提取 严格按照DNA提取试剂盒上的说明书进行，采用标准的酚、氯仿方法提取宫颈癌标本组织中的DNA。

1.3.4 扩增HPV16型E7基因 (1)设计特异性引物：以GenBank收录的德国标准株全序列DNA为样板，做适当调整后，自行设计包含HPV16型E7基因完整阅读框(562-858)在内的特异性引物：下游引物：5′-GGAAGCTTTTATGGTTTCTGAGAAC-3′；上游引物：5′-GCGAATTCATCATGCATGGAGATACACC-3′；同时在上游引物5′端设计了EcoRI酶切位点，在下游引物5′端设计了HandIII酶切位点。

(2)以宫颈癌组织标本癌细胞中提取的DNA作为模板，用PCR法在HPV16型的特异性引物的作用下进行型别鉴定，之后用E7基因的特异性引物PCR扩增HPV16型E7基因。扩增参数定为：94℃5 min，94℃40 s，57℃1 min，72℃1 min，四个步骤循环30次，最后一次循环72℃延伸6 min。

1.3.5 克隆HPV16型E7基因 对经PCR扩增所得产物用1%琼脂糖凝胶电泳找到E7扩增带，把相应的凝胶片段用凝胶回收试剂盒回收，将目标片段与载体pGEM-Teasy连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，经过蓝白斑筛选，最后用HandIII、EcoRI双切酶进行酶切鉴定。

1.3.6 测定HPV16型E7基因的序列 由上海生工生物工程公司对HPV16型E7基因的序列进行测定。运用DNAStar软件分析所测得的E7基因序列。

2 结果

2.1 PCR扩增HPV16 型E6、E7基因的结果

以本例宫颈癌患者手术切除标本癌细胞中的DNA 为样板,在高保真Taq酶的作用下，PCR法扩增HPV L1基因，将PCR扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳,在约500 bp 处清晰可见到一特异的条带(图1),与预计片断大小一致。

2.2 HPV16型 E6、E7基因重组质粒的构建

将PCR 扩增所得产物回收后，连接线性克隆载体pGEM-Teasy,构建成了HPV16 E6E7 2p GEM-Teasy重组质粒。之后将前述的重组质粒经转化，以及Hand Ⅲ和EcoRI双酶切鉴定后，进行阳性克隆筛选。结果酶切电泳显示预计的片段与重组质粒的插入片段大小一致(图2)。

图1 HPV16 E6E7基因的PCR扩增结果

图2 HPV16 E6E7重组质粒

2.3 HPV16型 E6、E7 基因序列测定及分析

由上海生工生物工程技术服务有限公司将插入的重组质粒用T3、T7通用引物从正、反两个方向测序,测序得深圳地方株HPV16型 E6、E7基因序列。用DNAStar软件比较GenBank收录的德国标准株HPV16型E6、E7基因序列和本研究中测序克隆所得的HPV16型 E6、E7 基因序列,结果表明德国标准株HPV16 型E6、E7基因序列与本研究中克隆的HPV16型 E6、E7 基因序列完全相同。

3 讨论

多项研究资料表明高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)是一种嗜组织鳞状上皮细胞DNA的无包膜病毒,其基因组约长8 kb,呈双链高度螺旋化的环状结构,包含3个功能区：长控制区(long control region,LCR)、早期基因区( E 区)和晚期基因区(L 区)。其中早期转录区基因组长约4 500 bp,包含6个开放读码结构(ORF),它们分别编码E1 、E2-E7 6 个早期蛋白,共同参与病毒DNA的转录、复制、细胞转化、翻译和调控等过程。其中HPV16型 E6 基因组全长包含477 个核苷酸,从83 位到559 位,分别对151 个氨基酸残基的病毒原癌蛋白进行编码。E6基因与p53的相互作用是E6 基因的致癌关键，它可引起p53 降解、功能减弱甚至丧失,使其减弱或丧失对细胞增殖周期中多个相关因子，如Cyclins、p21、Cdks、PCNA 等因子的调节作用,不断加重了细胞中DNA 受损，最终导致细胞癌变[4]。E7基因组全长包含297个核苷酸,从562 位到858 位,分别对98 个氨基酸残基的病毒原癌蛋白进行编码,该基因组是病毒的主要转化基因,它编码了病毒的E7 蛋白，后者是含有“Cys2X2X2Cys”锌指结构的细胞DNA结合蛋白。E7 蛋白的C 端有2 个锌指结构,N 端有37个氨基酸，是E7蛋白的活性转化区,其结构与SV40 T和腺病毒E1 A 抗原的结构类似,能与抑癌基因蛋白Rb、P53等相结合,干扰后者的抑癌功能,可导致机体细胞恶性转化、永生化以及使细胞维持恶性的表型[6]。Song等[7]认为,在 HR -HPV致癌过程中,在癌产生的早期E7基因主要导致细胞转形,在癌产生的后期E6基因主要引起细胞恶化。

众多研究人员在不同地区和国家从不同角度对当地HPV16型E6、E7基因分析的过程中，发现不同地区HPV16型E6、E7基因之间存在一些细小差异。目前研究结果显示,HPV16 型不同类型的变异株具有不同的致癌潜能和生物学活性[8]。有研究认为,病毒的致癌能力的强弱一方面与病毒的变异和类型相关,另一方面也与宿主的HLA 多态性相关。因此病毒变异株的致癌能力可能会因为地区不同而发生某些变化[9]。Yamada Matsumoto等[9]报道在日本宫颈癌患者中野生型E6 基因(德国株)分布的频率大概为34%,然而Zehbe 等[8]报道在瑞士宫颈癌患者中该基因分布频率仅约为6%,与印度宫颈癌患者人群中该基因的分布频率是基本相同的[10]。参考世界各地文献,T350G是最有特征性的E6 基因突变，但在不同的地区此变异的分布频率不同,为3.8%-78%。在我国，高慧等[11]设计了一对跨越HPV16型 E7基因全长的引物，进行序列测定后，与网上公布的非洲株、东亚株、德国标准株、香港株、亚美株等HPV16型 E7基因序列予以比较，发现在核苷酸水平上扬州地方株与德国标准株99.7%是一致的，仅在E7基因的ORF199位上的T变成了C，即核苷酸三联密码TTG变成CTG，但其所编码的氨基酸结构与德国标准株一致，尤其是N端蛋白活性转化区的37个氨基酸以及C端的60个氨基酸完全相同，说明了德国标准株(野生型)与扬州地方株的HPV16型E7基因序列是大致相同的。学者们根据各地文献所报道不同地区HPV16型 E7基因序列，制作了该基因序列的系统发育进化图，该图清晰显示东亚株、香港株、德国标准株与扬州地方株距离接近，可视为是一个系列，而非洲株和亚美株则相互接近，可视为是另一个系列，提示HR-HPV16型 E6、E7基因的突变具有明显的地域性差异。伍欣星[12]等研究发现湖北地区HPV16型E7基因了出现新的变异株，经序列测定显示有两个碱基出现了C→T突变，直接导致这两个碱基所编码的氨基酸序列的C端蛋白多肽因基因的突变提前终止，但N端则是完整的。

本组资料从深圳地区1例宫颈癌患者临床手术标本组织中成功扩增出HPV16型 E6、E7 基因,克隆到pGEM-Teasy载体中,再经酶切鉴定、测序后发现所克隆的HPV16型 E6、E7 全基因序列与Genebank 德国株序列完全一致,为日后进一步研究HPV 16 型E6、E7 基因及其蛋白表达提供了资料,为与HPV16型相关的宫颈癌治疗性疫苗及诊断试剂的研发及宫颈癌防治等工作提供了信息。

作者简介：关嵩青(1968-)，女，副主任医师，主要从事妇产科临床宫颈病变筛查及治疗工作。

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