钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白系统在雄性生殖调控中的研究进展

朱桂玉

(泰山学院生物与酿酒工程学院，山东泰安 271021)

钙蛋白酶(calpain)是一个依赖于Ca2+的半胱氨酸蛋白酶(通过半胱氨酸位点水解蛋白)，它水解的蛋白能在一系列生理、生化反应中发挥作用，包括细胞骨架的形成、细胞增殖、信号传导、细胞调亡与坏死、细胞内物质运输、蛋白的合成和降解等.钙蛋白酶与多种疾病有关，包括糖尿病、白内障、细胞硬化症、癌症、杜氏肌营养不良、老年痴呆等.

1 钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白

在人类中，钙蛋白酶家族一共有14个成员，在其众多成员中，钙蛋白酶1(calpain－1/μ－calpain)和钙蛋白酶2(calpain－2/m－calpain)研究的最为深入.体外研究表明，各calpain成员对Ca2+的敏感度不同，5－50μM的Ca2+浓度能刺激calpain－1达到最大活性，而当Ca2+浓度为0.2－1μM能使calpain－2 活性达到最大.［1］

Calpain的众多成员按其表达规律可以大致分为两类，第一类是在各种细胞中组成性表达的，包括calpain －1，2，5，7，10，13 和15;其余的只在某一种或几种细胞中表达，包括 calpain －3，6，8，9，11 和 12.比如calpain－11只在睾丸中表达，calpain－6只在胎盘中表达，calpain－3在骨骼肌，心肌和肝中特异表达［2］.

Calpain的激活原理以及其作用于靶蛋白的具体机制非常复杂，calpain的活性可以被一种特异的钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)所调控，而迄今所确定的calpastatin的唯一作用就是抑制calpain的活性.Calpastatin由唯一一个基因编码，但是它却能运用不同位置的启动子以及选择性剪切产生十几种异构体，最后翻译成分子量为17－100多kDa不等的各种蛋白.虽然产生大量异构体的具体作用还有待于进一步研究，但它们都能结合到calpain上的三个位点，其中两个位点的结合必须有Ca2+的参与［1］.

由于calpain－calpastatin系统在一系列生理过程中发生重要作用，因此机体需要对其进行精细而有效的调节，近年来，随着对calpain和calpastatin系统在生殖发育中的研究的逐步深入，人们发现calpain－calpastatin系统对精子和卵母细胞的发育、顶体反应、受精以及一些常见生殖疾病，如睾丸扭转、妊娠高血压综合症等有重要作用，本文将对calpain－calpastatin系统在雄性生殖发育过程中的调控机制进行下总结.

2 雄性生殖系统中钙蛋白酶—钙蛋白酶抑制蛋白的调控

最早关于calpain－calpastatin系统在雄性生殖发育中的研究始于1986年，Schollmeyer用免疫荧光技术将calpain－2定位于猪精子的顶体部位和中心粒附近，考虑到顶体反应和Ca2+浓度密切相关，因此Schollmeyer预测calpain－2可能参与了顶体反应［3］.Rojas等第一次在人的精子细胞内对calpain－calpastatin系统进行了较全面的定位研究，发现calpain－1和calpain－2在精子细胞中都有分布，同时，他用免疫印记的方法获得了一条68 kDa大小的calpastatin蛋白条带［4］，也有研究人员在人精子细胞中得到了除68kDa以外的另一条为110kDa左右的calpastatin蛋白［5］.

Calpain家族众多成员中已经确定calpain－1，calpian－2和calpain－11在睾丸中存在，通过western杂交证明精子中的calpain－1和calpain－2蛋白与其他组织中的并无差异［4，6］，而calpain－11则是在睾丸中生精细胞特异表达，其蛋白序列和结构与较保守的calpain－1和calpain－2有一定的区别，但其主要功能域都是保守的［7］.人的睾丸特异calpastatin蛋白大小大约为68kDa，由一个40个氨基酸组成的N端结构域和结构域II，III和IV组成，其中N端结构域为睾丸特异的，其余结构域部分和其他体细胞calpastatin蛋白完全一样［5］.通过绿色荧光蛋白示踪技术对其N端结构域进行研究，发现其能引导calpastatin蛋白定位于膜上.而在小鼠中睾丸特异calpastatin蛋白中也观察到了类似的N端结构域，并发现这个结构域内的一个十四烷基化位点对其膜定位有关键作用，对这个位点进行定点突变后calpastatin均匀分布于精子内［5］.

2.1 钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白在精子发育过程中的表达

Sultana研究了calpain在精子发育过程中的表达变化规律，发现calpain1在大鼠生长到20－25天左右时，即精母细胞(spermatocytes)发生减数分裂的旺盛时期，睾丸中的calpain－1基因表达量有显著的升高，他预测calpain－1在精子细胞发生过程中有重要作用，而calpain－2保持相对稳定［8］.在小鼠中，在精子发育的各个阶段都能检测到calpain－1和calpain－2的mRNA以及蛋白的表达，而calpain－1在晚期的次级精母细胞(second spermatocytes)和早期的精细胞(spermatids)中表达量显著升高［9］，这一现象与大鼠中的相同.Calpain－2在小鼠精子发育中的表达也相对稳定，与calpain－1不同的是，calpain－2在输精管的周围细胞中也有少量表达［9］.Calpain－11是睾丸特异表达的蛋白，经检测发现calpain－11的mRNA和蛋白在处于粗线期的精母细胞(pachytene spermatocytes)中才开始表达，同样在成熟精子的顶体部位也能检测到其蛋白存在［7］.

Wei等利用荧光原位杂交技术对calpastatin在人睾丸中进行了定位和表达分析，发现calpastatin的mRNA在精细胞中大量分布，由于精细胞是由次级精母细胞经过第二次减数分裂后产生的，说明calpastatin在减数分裂后的精子发育中有重要作用［10］.同样，在小鼠中，calpastatin基因只在单倍体的生殖细胞中表达，如精细胞，而在双倍体的生殖细胞中没有表达，如精母细胞［5］.

总结各研究结果发现，calpain－1和calpain－2在各种生精细胞中都有表达，而calpastatin在还未发生减数分裂的精母细胞中没有表达，只在进入减数分裂后的精母细胞中表达，由于发生减数分裂的精母细胞是发生调亡程度较高的细胞，因此calpastatin的这种时期特异表达可能与精母细胞的调亡有一定联系.精母细胞自身发生调亡，将活力低和有突变的细胞淘汰掉对提高精子质量有重要作用.Somwaru等成功的用转基因小鼠的方法将calpastatin基因在精母细胞中进行异位表达，接着利用热刺激诱导睾丸内的细胞发生调亡，结果显示粗线期的精母细胞是发生调亡程度最高的细胞，而转基因小鼠中调亡细胞的数量比正常小鼠显著减少，说明calpastatin有抑制精母细胞调亡的作用［11］.Coureuil等利用一个不育转基因小鼠品系(MTp53)，该小鼠能在次级精母细胞和精细胞中异位过表达P53，使这些细胞发生调亡而产生不育.经检测发现calpain－1在这两类细胞中表达升高，而当加入calpain的抑制剂后，细胞的调亡现象在一定程度上被抑制，说明calpain在这两类细胞的调亡过程中起到了关键作用［12］.以上结果分别从正反两方面证明了calpain－calpastatin系统在生精细胞的末端分化和调亡过程中发挥了重要作用.

2.2 钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白在精子中的分布与顶体反应

研究人员对calpain－calpastatin蛋白在精子中的空间分布规律进行了大量研究，发现calpain主要分布在精子头部的顶体部位［5，6，9］以及颈部［13］，进一步的研究发现在短尾猕猴的精子的顶体外膜和细胞浆膜之间，分布于大量的calpain－1和calpain－2蛋白［14］.Calpastatin蛋白也主要分布在精子头部相同的区域［14］.Ozaki等发现在体外的精子中加入少量孕酮后，精子内的钙离子浓度显著升高，同时还使calpain－1蛋白，由头颈部转移到颈部和尾部，但是具体机制不明确［13］.

获能的精子渗入卵母细胞前要发生顶体反应(acrosome reaction)，而Ca2+是顶体反应中所必须的，calpain－calpastatin蛋白在顶体附近的分布以及其与Ca2+浓度的密切关系说明该系统可能在顶体反应中发挥了重要作用.Rojas和Moretti－Rojas最早对calpain－calpastatin系统在顶体反应中的作用进行了研究，发现在精子中加入calpain的抑制因子(calpain inhibitor－I)后，精子的渗入率显著降低，但是该抑制因子对精子活力以及卵母细胞没有明显作用，此外，加入calpain－1和calpain－2的抗体同样对顶体反应有抑制作用［15］.随后，大量研究表明calpain的各种抑制剂能不同程度的降低精子活力以及抑制顶体反应的发生［6，13，9，16］.Ashizawa等首次对禽类的精子中的 calpain 蛋白进行了研究，由于禽类动物的体温为40℃，其顶体反应和受精机理与哺乳动物有一定的区别.Ashizawa等发现Ca2+浓度在鸡的精子活力和顶体反应中发挥了关键的作用，体外实验表明，Ca2+浓度升高可以提高鸡精子的活力和促进顶体反应，而用PD 150606(特异的calpain抑制剂)对精子进行处理后，对顶体反应没有影响，但对精子的活力有抑制作用，进一步的实验发现PD 150606对去膜后的精子的活力没有影响，说明发挥功能的calpain蛋白主要分布在鸡精子的膜部位［16］.

3 钙蛋白酶－钙蛋白酶抑制蛋白与某些雄性生殖疾病的关系

雄性哺乳动物的睾丸扭转(Testicular torsion)会导致睾丸内细胞的缺血并发生坏死或者调亡，细胞会产生大量的一氧化氮，同时calpain蛋白的活性也显著升高，在此过程中如加入calpain的抑制剂，抑制calpain的蛋白水解活性，可以抑制精原细胞的调亡和坏死，从而说明抑制calpain可以对睾丸扭转损伤的恢复有一定作用，calpain蛋白可以作为治疗睾丸扭转一个药物靶点［17－18］.Umemoto等进一步研究了发生睾丸扭转过程中未发生损伤的细胞中的calpain蛋白的变化，发现当大鼠一侧的睾丸发生睾丸扭转损伤后，在另一侧的睾丸的精母细胞核中发现了大量的calpain－1，而calpain－2没有观察明显的变化，在未发生损伤的外周细胞中同样发现了调亡的现象，而calpain抑制剂也可以抑制这些细胞的调亡［19］.

4 展望

总之，目前的研究表明calpain－calpastatin在雄性生殖系统中发挥着重要作用.随着对calpaincalpastatin在生殖系统中的研究的逐渐深入，有望对这一系统在生殖调控方面的功能和发挥作用的具体机制有更准确的了解，在临床上可以利用它们作为药物的靶位点，为治疗相关疾病提供新途径，还可以运用到动物生产领域，提供动物的繁殖力，更好的为人类服务.

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