人参多糖对冷暴露卵巢细胞功能影响

尹旭辉，王洪军，孙 艳，蒋彤，尹忠伟，杨成君，杨义军

1.沈阳军区联勤部疾病预防控制中心，辽宁 沈阳 110034；2.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016

卵巢作为下丘脑-垂体-性腺轴作用的靶器官，受到寒冷因素的作用后，生殖周期的功能会发生不同变化[1]。有文献报道，一次性冷应激人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导大鼠卵巢黄体与颗粒细胞分泌功能发生变化[2]。人参多糖是人参的重要生理活性有效成分，药理学研究表明，人参的“适应原”样作用是人参多糖的作用结果之一[3]。本文探讨大鼠黄体与颗粒细胞重复暴露不同强度的寒冷环境分泌功能的变化及应用人参多糖体外干预作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 Wistar大鼠[SCXK(辽)2003-0009]，体重250～300 g，健康雌性，分笼饲养，自由饮水进食。适应性饲养1周后进行实验。

1.1.2 细胞 黄体细胞与颗粒细胞取自大鼠卵巢。

1.1.3 分组 黄体细胞分为Ⅰ组和Ⅱ组，颗粒细胞分为Ⅲ组和Ⅳ组，Ⅰ组和Ⅲ组分别进行37、4、0 ℃环境温度暴露，Ⅱ组和Ⅳ组经人参多糖干预后再分别进行37、4、0 ℃环境温度暴露。

1.1.4 试剂与仪器 MoCoy′s 5a培养基干粉、胶原酶、孕酮、人绒毛膜促性腺激素(购自美国Sigma 公司)，小牛血清(购自上海生物工程公司)，孕马血清(购自天津实验动物中心)，3 H-孕酮(购自上海生物制品研究所)，125I-cAMP 放免药盒(购自上海中医学院)。CO2培养箱(美国Shel-Lab公司，型号1815TC)，超净工作台(江苏苏州安泰空气技术有限公司，型号SW-CJ-2FD)，倒置相差显微镜(日本Olympus 公司，型号CX21FS1)，低温离心机(美国Beckman公司，型号J 2221，r=13.5 )，液闪仪(瑞典LKB公司，型号LKB1211 )，γ-计数仪(瑞士公司，型号Kontro-28D)[4]。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

1.2.1.1 黄体细胞的制备与培养 大鼠颈部皮下注射孕马血清50 U/只，48 h后皮下注射HCG 45 U/只，1周后无菌取卵巢，将黄体化卵巢剪碎，0.2%胶原酶5 ml消化，置37 ℃培养箱，每隔15 min用吸管吹打；1 h后，加入MoCoy′s 5a培养液5 ml，混均匀，200 r/min离心2 min，弃沉淀，1 300 r/min离心10 min，弃上清，加入培养液10 ml，1 300 r/min离心10 min，洗2 次。加培养液，混均匀，取50 μl，与0.4%锥虫蓝50 μl混匀，细胞计数。用含5%胎牛血清MoCoy′s 5a培养液调整细胞数为1×106/ml[4]。Ⅰ组细胞接种24 孔培养板，5% CO2、37 ℃培养24 h，无血清MoCoy′s 5a 培养液0.5 ml洗1次，加无血清培养液1 ml，37、4、0 ℃环境暴露，每次8 min。水浴复温后，37 ℃继续培养48 h，重复2次，第3次暴露复温后黄体细胞用无血清培养液分别培养48 h，收集培养液，煮沸5 min，-20 ℃冻存，用于孕酮与cAMP放免测定。Ⅱ组细胞培养液中加人参多糖，终浓度30 ng/ml，处理方法同Ⅰ组细胞。

1.2.1.2 颗粒细胞的制备与培养 大鼠腹部皮下注射去氢已烯雌酚油剂，按每只0.5 mg/0.1 ml，连续注射4 d。第5天无菌取卵巢，将去氢已烯雌酚油剂处理的大鼠卵巢用小号针头刺破卵泡，释放出颗粒细胞。离心，收集细胞，加适量培养液，取细胞悬液50 μl，加0.4%锥虫蓝50 μl，计数细胞与活细胞百分率。按活细胞数用5%胎牛血清MoCoy′s 5a培养液调整细胞数为1×106/ml[4]。Ⅲ组细胞接种24孔培养板，5%CO2、37 ℃培养24 h，进行37、4、0 ℃环境温度暴露，每次8 min。水浴复温后，37 ℃继续培养24 h，重复2次，第3次暴露复温后黄体细胞用无血清培养液分别培养48 h，收集培养液，煮沸5 min，-20 ℃冻存，用于孕酮与cAMP放免测定。Ⅳ组细胞培养液中加人参多糖，终浓度30 ng/ml，处理方法同Ⅲ组细胞。

1.2.2 甾体激素与cAMP含量的测定 孕酮的放免测定操作过程，按3H-孕酮试剂盒说明书进行；cAMP 的放免测定操作过程，按125I-cAMP放免试剂盒说明书进行。

1.3 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1 黄体与颗粒细胞冷暴露后孕酮生成量的变化及人参多糖干预作用(表1) Ⅰ组黄体细胞于4 ℃冷环境中暴露3次，与对照组(即37 ℃环境暴露)比较，孕酮生成量均有所升高；于0 ℃冷环境中暴露1次后，孕酮生成量升高，0 ℃冷环境中暴露2次后，孕酮生成量明显降低(P<0.05)；0 ℃冷环境中暴露3次后，孕酮生成量明显降低(P<0.01)。Ⅱ组黄体细胞于4 ℃冷环境中暴露3次，与对照组比较，孕酮生成量变化差异无统计学意义；于0 ℃冷环境中暴露1次后，孕酮生成量升高，0 ℃冷环境中暴露2次后，孕酮生成量降低，0 ℃冷环境中暴露3次后，孕酮生成量继续降低，但高于Ⅰ组数值，差异有统计学意义(P<0.05)。

Ⅲ组颗粒细胞于4 ℃冷环境中暴露3次，与对照组(即37 ℃环境暴露)比较，孕酮生成量均为升高趋势；于0 ℃冷环境中暴露1次后，孕酮生成量升高，0 ℃冷环境中暴露2次后，孕酮生成量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；0 ℃冷环境中暴露3次后，孕酮生成量持续明显降低(P<0.05)。Ⅳ组颗粒细胞于4 ℃冷环境中暴露3次，与对照组比较，第1次至第3次冷暴露孕酮生成量均为升高趋势，于0 ℃冷环境中暴露1次后，孕酮生成量升高，0 ℃冷环境中暴露2次后，孕酮生成量降低，但明显高于Ⅲ组数值(P<0.05)，0 ℃冷环境中暴露3次后，孕酮生成量明显降低(P<0.05)。

表1 人参多糖对冷暴露黄体和颗粒细胞孕酮生成量的调节(n=10，±s，pmol/106细胞)

注：组内与37 ℃比较，aP<0.05，bP<0.01；组间比较，cP<0.05。

2.2 黄体与颗粒细胞冷暴露后cAMP生成量的变化及人参多糖干预作用(表2) Ⅰ组黄体细胞，于4 ℃冷环境中暴露3次，与对照组比较，cAMP生成量均明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；于0 ℃冷环境中暴露1次后，cAMP生成量明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，0 ℃冷环境中暴露2次后，cAMP生成量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，0 ℃冷环境中暴露3次后，cAMP生成量明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。Ⅱ组黄体细胞于4 ℃冷环境中暴露1～2次后，与对照组比较，cAMP生成量呈明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。4 ℃冷环境中暴露3次后，cAMP生成量较冷暴露1～2次有所下降，但较对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；于0 ℃冷环境中暴露3次，cAMP生成量均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，冷暴露2～3次后明显高于Ⅰ组数值，差异有统计学意义(P< 0.01)。

Ⅲ组颗粒细胞于4 ℃冷环境中暴露3次，与对照组比较，cAMP生成量均明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；于0 ℃冷环境中暴露1次后，cAMP生成量明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，0 ℃冷环境中暴露2～3次后，cAMP生成量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；Ⅳ组颗粒细胞于4 ℃冷环境中暴露3次，与对照组比较，cAMP生成量均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，于0 ℃冷环境中暴露3次，cAMP生成量与对照组比较均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，第2～3次冷暴露后生成量明显高于Ⅲ组数值，差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 人参多糖对冷暴露黄体和颗粒细胞cAMP生成量的调节(n=10，±s，fmol/106细胞)

注：组内与37 ℃比较，aP<0.05，bP<0.01；组间比较，cP<0.01。

3 讨 论

研究资料表明，寒冷作为应激原作用于动物机体可产生明显影响，如神经内分泌变化、能量代谢变化及组织细胞学变化，但变化规律存在差异，并非一致，究其原因与受试对象的种属、数量、性别、年龄、生理状况以及受试因素的条件、强度、时间、方法不同等相关[5]。cAMP是神经内分泌系统重要传递通路的信使，参与神经递质、内分泌激素的合成分泌[6]，引起多种细胞效应。在下丘脑-垂体-性腺系统的功能活动中，卵泡刺激素(FSH)是其主要激素，诱导卵巢细胞合成孕酮，这一细胞效应的实现主要通过激活cAMP信号通路进行有效调控[6]。

本实验结果表明，不同冷暴露强度与重复冷暴露影响卵巢黄体与颗粒细胞的孕酮水平和cAMP水平，4 ℃冷暴露后均升高，重复暴露后升高趋势不变；0 ℃重复冷暴露后呈下降改变。结果提示，增加冷暴露强度及重复冷暴露，可使应激反应发生变化，反馈抑制作用也可能参与其变化[7]。

人参多糖自1969年成功分离出以来，研究证明其具有对有害刺激的抵御抗力，增强机体的应激能力和适应性[8]。本研究表明，人参多糖具有保护卵巢细胞功能的作用，冷暴露后孕酮和cAMP水平的增高和下降幅度明显减少，有效地进行了适应性的调节。

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[4] 吴扬，年春志，冯立，等.人参多糖对低温应激大鼠黄体与颗粒细胞功能的影响[J].中国妇幼保健，2006，21(16)：2263-2265.

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