JNK蛋白在白藜芦醇抗心肌缺血再灌注损伤中作用

王 冰，于 明，武 岳，李 川，姚天明

沈阳军区总医院心血管内科，辽宁 沈阳 110016

中药虎杖为蓼科蓼属多年生草本植物虎杖的干燥根和茎，叶亦入药。其性味苦寒，归肝、肺、胆经。主要功效为祛风利湿，祛痰止咳，清热解毒，活血化瘀。其主要有效成分白黎芦醇具有扩血管、抗血栓、抗休克、降血脂及抗氧化等作用。实验研究表明，白藜芦醇预处理能明显减轻大鼠脑缺血引起的脑损伤[1]。随着对白藜芦醇的不断研究，其保护作用也进一步扩大。有文献报道，其对肾脏、肝脏、肠、视网膜以及肢体等器官和组织的缺血再灌注都有保护作用[2-6]。本研究通过制作离体大鼠心肌缺血再灌注模型，并给予白藜芦醇预处理，观察白藜芦醇对缺血再灌注心肌的保护作用并研究其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 成年SD大鼠36只，体重200～250 g，雄性，由沈阳军区总医院动物中心提供。

1.2 药品试剂 白藜芦醇注射液(河南海鑫动物药业)， 肌酶激酶(CK)(A032)、乳酸脱氢酶(LDH)(A020)、超氧化物歧化酶(SOD)(A001)和丙二醛(MDA)(A003)。试剂盒均由南京建成生物工程研究所购得，肝素钠注射液。

1.3 方法

1.3.1 离体心脏灌流液 改良的Krebs-Henseleit(K-H)液，主要成分为(单位：mmol/L):NaCl 118.9，KCl 4.7，CaCl22.2，MgSO41.2，KH2PO41.2，NaHCO317.9，EDTA 0.03，Glucose 10，超纯水配制。

1.3.2 模型制作 用3%戊巴比妥钠 (0.1 ml/100 g)腹腔注射麻醉后将大鼠背位固定，切开腹腔，下腔静脉注入3%浓肝素(0.1 ml/100 g)以防血栓形成。迅速开胸剪去胸廓，显露心脏及大血管，剪断肺静脉。迅速取出心脏，放入预冷(4 ℃)的改良K-H液中，排出心腔内残余血液，经主动脉逆行插管并结扎，悬挂于Langendorff装置上。另将球囊测压管经左心耳通过二尖瓣插入左心室，经换能器连在多导生理记录仪上，调节左心室内球囊的容积使左心室的舒张末期压力为7～9 mmHg。将心脏置于37 ℃保温灌流室内，于 Langendorff心脏灌流装置主动脉逆行灌注K-H缓冲液，以冲洗残留于心脏的血液，灌流液恒温(37 ℃)，恒压(60 mmHg)，并为100% O2饱和。平衡灌注15 min后，停灌(阻断主动脉灌注管，缺血)30 min，随后恢复灌注40 min。

1.3.3 分组及用药 随机将36只大鼠分成3组：对照组、缺血再灌注组和白藜芦醇组。对照组：正常K-H液灌流85 min；缺血再灌注组：K-H液预灌流15 min，停灌30 min， 再灌注40 min；白藜芦醇组：先灌注含药物15 mg/L的K-H液15 min，停灌30 min，再灌注40 min。

1.3.4 心功能指标测定 利用多导生理记录仪分别测量各组缺血前、复灌20 min、复灌40 min时心功能指标：心率(HR)、左室舒张压(LVDP)、左室舒张末压(LVEDP)、心室内压最大变化速率(±dp/dtmax )。

1.3.5 LDH和CK检测 分段收集流出液(缺血前、复灌20 min、复灌40 min)，按试剂盒说明书，采用比色法测定LDH和CK活性。

1.3.6 心肌梗死体积检测 实验结束时，每组从剩余大鼠中再随机选取6只，经主动脉逆行灌注0.5%伊文思蓝2～3 ml。心脏称重后，放于- 80 ℃冰箱中冻存，30 min后将心脏沿长轴均匀切为6～9片，并浸泡于pH 值为7.4、浓度为10 g/L 的TTC磷酸缓冲液中，于37 ℃水箱孵化20 min，染色，后置于10%福尔马林固定，取出后可观察到缺血危险区为红色，梗死区为白色。在图像分析软件(Sigma Scan program 4)下计算出缺血危险区(AAR)和梗死区(IS)的体积，心肌梗死体积以IS/AAR来表示。1.3.7 JNK水平检测 取出剩余心脏，置于冰屑上，剪取左心室全部心肌组织，心肌组织加入4倍体积细胞裂解液，研磨和超声裂解并离心，收集上清液，考马斯亮蓝法进行蛋白质定量。SDS-PAGE分离样品后电泳转移至硝酸纤维膜上，TBS-T液室温封闭1 h 后，加入一抗(抗磷酸化JNK的兔多克隆抗体或抗JNK的兔多克隆抗体)，室温下免疫沉淀1 h，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下作用2 h。洗膜，显色。采用Quantity one图像分析软件分析扫描条带的灰度值。

2 结 果

2.1 各组心功能指标检测结果(表1) 与对照组相比，缺血再灌注组大鼠在心肌缺血时HR降低，LVDP以及±dp/dtmax下降，LVEDP则升高(P<0.05)。在再灌注期间，上述指标虽可逐渐恢复，但仍未能达到心脏缺血前水平，说明离体心脏缺血再灌注模型建立成功。与缺血再灌注组相比，白藜芦醇组大鼠心肌再灌注20、40 min的HR变快，LVDP和±dp/dtmax明显上升，而LVEDP则明显下降(P<0.05)。表明白藜芦醇对缺血再灌注心脏功能有明显的保护作用。

2.2 心肌LDH、CK检测(表2) 在缺血再灌注过程中，心肌细胞内的CK、LDH漏出增加，与缺血前相比差异有统计学意义(P<0.05)。白藜芦醇治疗组再灌注20、40 min的CK、LDH与缺血组相比，CK、LDH漏出明显减少(P<0.05)。

表1 3组心功能指标测量结果±s，n=6)

注：对照组与缺血再灌注组缺血前相比，aP<0.05；白藜芦醇组与缺血再灌注组相比，bP<0.05。

表2 白藜芦醇对离体缺血再灌注大鼠心肌CK和LDH的影响±s，n=6)

注：对照组与缺血再灌注组缺血前相比，aP<0.05；白藜芦醇组与缺血再灌注组相比，bP<0.05。

2.3 心肌梗死体积检测结果(表3) 与缺血再灌注组相比，白藜芦醇治疗组的AAR由(0.473±0.087)cm3下降到(0.343±0.112)cm3，而IS/AAR的数值则从(49.323±14.002)降低到(30.021±9.834)，P<0.05。表明白藜芦醇使缺血再灌注心肌损伤减轻，缩小梗死体积。

表3 白藜芦醇对离体缺血再灌注大鼠心肌梗死 体积的影响±s，n=6)

注：白藜芦醇组与缺血再灌注组相比，aP<0.05。

2.4 心肌JNK水平检测结果(图1) 与对照组相比，缺血再灌注组和白藜芦醇组心肌组织中JNK的总量差异无统计学意义。缺血再灌注过程中，心肌组织中JNK的磷酸化水平明显升高，而白藜芦醇治疗组可以使JNK的磷酸化水平明显恢复(P<0.05)，但不能达到正常水平。

注： 缺血再灌注组与对照组相比，aP<0.05；白藜芦醇组与>缺血再灌注组相比，bP<0.05。

图1 白藜芦醇对离体缺血再灌注大鼠JNK的影响

3 讨 论

心肌缺血再灌注损伤过程中，再灌注引发的氧自由基增多及Ca2+超载可能损伤细胞结构及细胞功能，使细胞能量代谢障碍，细胞膜通透性增加，并最终引起心肌细胞损伤，终末期各种代谢物质释放入血[7]。因此，血清CK和LDH活性及心功能的测定可作为观察心肌缺血再灌注损伤程度及药物疗效和预后的指标[8]。白藜芦醇属于植物酚类，是天然的抗氧化物以及自由基清除剂，主要存在于各种红葡萄果实中，具有广泛的生理药理作用，对其作用机制的研究也越来越广泛[9]。本研究首先通过制作心肌缺血模型，在器官水平通过检测心肌酶谱以及心肌梗死体积观察白藜芦醇的心肌保护作用，进而研究其可能作用的细胞信号转导通路，进一步阐明、丰富白藜芦醇的保护作用分子机制。

JNK细胞蛋白属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族的成员，是进化上偏于保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[10，11]。以JNK信号蛋白为中心的JNK信号转导通路可被细胞因子、生长因子以及物理刺激等多种因素激活[12，13]。活性氧可以通过影响激酶本身和激酶抑制物的活性激活JNK信号通路[14，15]。JNK蛋白自身包括磷酸化以及非磷酸化两种形式，磷酸化水平决定其活性，包含双磷酸化功能区Thr-Pro-Tyr与c-Jun氨基末端的活化区结合并使其第63、73位丝氨酸残基磷酸化。有报道，肝星状细胞被乙醛处理后JNK的磷酸化水平升高[16，17]。抑制JNK途径可发挥保护老年大鼠缺血再灌注后的神经元损伤等作用[18]，抑制JNK途径能明显改善大鼠心肌梗死体积及缺血再灌注的心脏收缩功能，提示JNK途径参与了缺血心肌的保护作用[19，20]。本研究结果也提示，白藜芦醇对缺血再灌注离体心脏具有明显的恢复心脏功能，加强收缩力等作用，能够减轻心肌细胞损伤，进而降低LDH以及CK指标，减小梗死面积，降低心肌梗死体积。这也进一步印证了白藜芦醇具有明显的心脏保护作用。本研究结果表明，白藜芦醇通过抑制了离体缺血再灌注大鼠心肌中活性氧的产生和JNK的活化，抑制心肌细胞的凋亡，从而发挥心肌保护作用。

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