循环miRNA-141对前列腺癌的诊断和预后价值研究*

廖于峰， 戴金华△， 茅奇峰， 竺展坤， 贾广成

(宁波市第二医院 1检验科， 2泌尿外科，浙江 宁波 315010)

前列腺癌(prostatecancer,PCa)是男性常见的恶性肿瘤，是欧美国家男性癌症死亡原因的第2位，仅次于肺癌。在我国，前列腺癌已高居泌尿系统肿瘤的第3位，其发病率呈明显上升趋势，并且发病年龄也日趋年轻化。直肠指诊和血清前列腺特异性抗原(prostate-specificantigen，PSA)已经成为前列腺癌筛查最重要的指标，但直肠指检的敏感性低、PSA的特异性较差，特别是在PSA(2.0～10.0μg/L)范围内，前列腺癌和良性前列腺增生有相当多的重叠[1]。2009年发表在新英格兰医学杂志的2项大型研究——欧洲前列腺癌筛查随机化研究(ERSPC)[2]和前列腺、肺、结肠和卵巢肿瘤筛查研究(PLCO)[3]表明利用PSA来筛查前列腺癌对降低死亡率以及改善生活质量的有效性仍然不明确，PSA作为前列腺癌筛查的工具还存在很大的争议。因此，迫切需要研究一种新的非侵入性的早期诊断前列腺癌的方法。最新研究证实，在包括前列腺癌在内的肿瘤发生发展、转移等微观层面，细胞可能主动或被动释放肿瘤内源性的miRNAs进入外周循环，成为游离miRNAs[4]。游离miRNA是外周血肿瘤标志物，能够用于肿瘤诊断与预后。本研究采用实时荧光定量PCR检测PCa、良性前列腺增生(benignprostatehyperplasia,BPH)患者和健康对照血清miR-141的表达水平，研究其对前列腺癌诊断的价值，并分析miR-141的表达水平与PCa临床病理参数的的相关性。

材 料 和 方 法

1 临床资料

收集2009年1月至2013年1月期间在我院泌尿外科经病理活检确诊的PCa和BPH患者术前血清。其中PCa患者75例，平均年龄为(61.5±10.3)岁；BPH患者32例，平均年龄(59.4±7.8)岁。所有疾病术前未行任何治疗、放疗和化疗。具有下列情况的个体未被纳入本研究：伴发其它恶性肿瘤、心血管疾病、糖尿病、肾病或其它可能影响miRNA表达的慢性疾病等。病理分级依据2003年WHO前列腺癌病理组织学分类标准Gleason评分，肿瘤分期按Jewett-Whitmore-Prout分期标准(即ABCD分期)。同期另择正常志愿者40例(对照组)，年龄为(58.9±9.5)岁。3组对象年龄的差异均无统计学意义(P>0.05)。采集标本前获得患者知情同意和宁波市第二医院伦理委员会批准，所有的血清标本保存在-80 ℃。

2 方法

2.1RNA提取 取患者血清300 μL，用mirVanaTMPARISTMmiRNA试剂盒(Applied Biosystems)提取总RNA。测定RNA浓度，吸光度A260/A280为1.8～2.1。

2.2实时荧光定量PCR以总RNA5μL为模板，应用TaqManMicroRNAReverseTranscription试剂盒(ABI)进行反转录，总反应体系为15μL，反应条件如下：16 ℃ 30min，42 ℃ 30min，85 ℃ 5min，其中反转录引物为miR-141特异性的茎环引物(TaqManMicroRNAAssays，ABI)。荧光定量PCR总反应体系为20μL：1.3μLcDNA模板，1μLmiR-141 (U6) 特异性引物，10μLTaqManUniversalPCRmasterMix(ABI)，7.7μLH2O。反应条件为：95 ℃ 10min，95 ℃ 15s，60 ℃ 1min，40个循环。所有反应均在ABI7500实时定量PCR仪上完成，每个样本重复3次，以U6为内参基因。采用2-ΔCt计算miR-141的相对定量表达水平，其中ΔCt=CtmiR-141-CtU6。

3 统计学处理

应用SPSS 16.0统计软件分析。计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，2组间均数比较采用两独立样本t检验,多组间比较采用单因素ANOVA分析和LSD-t检验。用MedCalc 7.5软件绘制ROC曲线,分析miR-141对前列腺癌的诊断价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 前列腺癌、良性前列腺增生患者和正常对照的血清miR-141表达水平

PCa、BPH和健康对照中血清miR-141的相对表达水平见图1，PCa组miR-141表达水平(18.36±3.85)较BPH组(6.11±2.02)和对照组(5.50±1.52)增加，差异有统计学意义(P<0.01)。但miR-141在BPH组和对照组中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。

Figure 1. The box plot of the serum miR-141 levels in the patients with PCa (n=75) and BPH(n=52), and healthy individuals (n=40). The expression levels of miR-141 are normalized to U6. **P<0.01 vs normal group or BPH group.

2 ROC曲线分析miR-141对前列腺癌的诊断价值

用Medlac软件构建ROC曲线显示miR-141能够较好地区分前列腺癌与BPH(或健康对照)，见图2。ROC曲线显示，miR-141区分前列腺癌和BPH的曲线下面积和95%置信区间为0.785(95% CI∶0.689～0.823)，最佳临界值为10.25时，敏感度和特异性分别为67.5%和70.0%(图2A)；miR-141区分前列腺癌和健康对照的曲线下面积为0.801(95% CI∶0.723～0.868)，最佳临界值为9.46时，敏感度和特异性分别为72.8%和76.4%(图2B)。

Figure 2. ROC curve analysis of using miR-141 to differentiate PCa (n=75) from BPH (A, n=52), or healthy controls (B, n=40).

3 血清miR-141表达水平与PCa临床病理参数的相关性

Gleason积分>7分组与<7分组miR-141的表达量分别为16.68±2.94和23.12±4.18，差异有统计学意义(P<0.05)。血清miR-141表达水平与临床分期相关(P<0.01)，随着临床分期的增加，miR-141的表达水平增加。此外，骨转移的前列腺癌miR-141表达量与未转移者相比，差异无统计学意义(P>0.05)。但miR-141表达量与肿瘤复发和PSA水平无关(均P>0.05),见表1。

讨 论

miRNA是一类新发现的、非编码的、大小为22nt左右的单链小分子RNA，通常在转录后水平调控基因表达。miRNAs与靶mRNA的3’端非翻译区并不完全互补配对，从而抑制基因表达，miRNA在细胞发育、凋亡、分化、增殖等重要的生理病理过程中发挥重要作用，许多恶性肿瘤中都观察到miRNAs的异常。近期，作为新的切入点，miRNA为癌症的诊断与治疗开辟了一条新途径。

研究发现miRNA不仅可以在血清中稳定存在，并且许多肿瘤患者血清中的一些miRNA的表达明显与正常人不同，血清miRNA有潜力作为一种特异的肿瘤标志物应用于临床。Lawrie等[5]第一个证实血清中存在肿瘤特异性miRNA ，他们发现弥漫性大B 细胞淋巴瘤患者的血清中miR-155、miR-210和miR-21表达量明显高于正常对照组，并且miR-21 的水平与存活率密切相关。其后，Mitchell 等[4]发现来源于肿瘤的miRNA能够稳定存在于血液中，并且miRNA的表达量能够反映肿瘤的大小，为循环miRNA的研究奠定了理论基础。近来Chen等[6]发现血浆microRNA表达谱可作为前列腺癌非侵入性的标志物，并且let-7c、let-7e、miR-30c、miR-622和miR-1285等5个miRNAs能够准确地区分前列腺癌和前列腺良性增生(AUC=0.924)。

表1 前列腺癌miR-141表达量与临床病理参数的相关性

本研究通过qRT-PCR检测PCa、BPH和健康对照血清中miR-141的相对表达水平，发现miR-141在BPH和对照组中的表达差异无统计学意义，但PCa组的miR-141表达水平明显高于BPH组，miR-141能较好地区分前列腺癌、BPH(或健康对照)，AUC分别为0.785和0.801。Lodes等[7]和Brase等[8]也发现前列腺癌患者血液miR-141显著升高，与本文结果一致。本研究还发现PCa患者血清miR-141水平与Gleason积分相关，Gleason积分>7的PCa患者血清miR-141水平明显增加；随着临床分期的增加，miR-141的表达水平增加；并且骨转移的PCa患者血清miR-141显著高于未转移者。Mitchell等[4]首先报道了进展性PCa患者循环miR-141水平明显增高，Bryant等[9]、Yaman Agaoglu等[10]和Selth等[11]也发现转移性PCa与miR-141水平相关，转移性前列腺癌miR-141水平高于未转移者。Brase等[8]表明miR-141是高风险肿瘤的标志物(Gleason积分>7或者远处转移)，循环miR-141水平与Gleason积分和淋巴结转移相关。Zhang等[12]进一步发现血清miR-141水平越高，骨转移病变的数目越多；并且血清miR-141的水平与血清ALP水平相关，但与血清PSA水平不相关。上述研究结果提示，血清miR-141可作为前列腺癌非侵入性诊断和预后的分子标志。

目前，循环miRNA释放入血液中的具体机制及其功能还不清楚。最近的研究表明,肿瘤细胞会选择性地把一些miRNA包裹到微囊泡(microvesicles)中，然后释放到循环系统中，这些miRNA利用微囊泡经循环系统被运输到靶细胞内，并作为内源性miRNA调控靶细胞相关基因的表达[13]。因此，循环miRNA不仅可作为肿瘤诊断和预后判断的标志物，还可以通过介导靶细胞的表达和信号转导而作为个性化治疗的潜在方法。由于循环miRNA的表达量较低，寻找灵敏度高、易于标准化操作的检测方法是miRNA应用于临床诊断亟待解决的问题。限于样本数量，本研究的结果还需在大样本、多中心的患者群体中进一步验证。

[参 考 文 献]

[1]PartinAW,OesterlingJE.Theclinicalusefulnessofprostatespecificantigen:update1994[J].JUrol, 1994, 52(5Pt1):1358-1368.

[2] Schröder FH, Hugosson J, Roobol MJ, et al. Screening and prostate-cancer mortality in a randomized European study[J]. N Engl J Med, 2009, 360(13):1320-1328.

[3]AndrioleGL,CrawfordED,GrubbRL3rd,etal.Mortalityresultsfromarandomizedprostate-cancerscreeningtrial[J].NEnglJMed, 2009, 360(17):1310-1319.

[4] Mitchell PS, Parkin RK, Kroh EM, et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(30):10513-10518.

[5]LawrieCH,GalS,DunlopHM,etal.Detectionofelevatedlevelsoftumour-associatedmicroRNAsinserumofpatientswithdiffuselargeB-celllymphoma[J].BrJHaematol, 2008, 141(5): 672-675.

[6] Chen ZH, Zhang GL, Li HR, et al. A panel of five circulating microRNAs as potential biomarkers for prostate cancer[J]. Prostate, 2012, 72(13):1443-1452.

[7]LodesMJ,CaraballoM,SuciuD,etal.DetectionofcancerwithserummiRNAsonanoligonucleotidemicroarray[J].PLoSOne, 2009, 4(7):e6229.

[8] Brase JC, Johannes M, Schlomm T, et al. Circulating miRNAs are correlated with tumor progression in prostate cancer[J]. Int J Cancer, 2011, 128(3):608-616.

[9]BryantRJ,PawlowskiT,CattoJW,etal.ChangesincirculatingmicroRNAlevelsassociatedwithprostatecancer[J].BrJCancer, 2012, 106(4):768-774.

[10] Yaman Agaoglu F, Kovancilar M, Dizdar Y, et al. Investigation of miR-21, miR-141, and miR-221 in blood circulation of patients with prostate cancer[J]. Tumor Biol, 2011, 32(3): 583-588.

[11]SelthLA,TownleyS,GillisJL,etal.DiscoveryofcirculatingmicroRNAsassociatedwithhumanprostatecancerusingamousemodelofdisease[J].IntJCancer, 2012, 131(3): 652-661.

[12] Zhang HL, Qin XJ, Cao DL, et al. An elevated serum miR-141 level in patients with bone-metastatic prostate cancer is correlated with more bone lesions[J]. Asian J Androl, 2013, 15(2): 231-235.

[13]SkogJ,WurdingerT,vanRijnS,etal.GlioblastomamicrovesiclestransportRNAandproteinsthatpromotetumourgrowthandprovidediagnosticbiomarkers[J].NatCellBiol, 2008, 10(12):1470-1476.