PFT-α对脑缺血后神经干细胞移植中PUMA的 调控研究

刘洋，雷旭辉，殷实，蒋传路

论著·基础

PFT-α对脑缺血后神经干细胞移植中PUMA的 调控研究

刘洋，雷旭辉，殷实，蒋传路

目的探索p53抑制剂(PFT-α)对脑缺血后神经干细胞(NSCs)中p53下游促凋亡基因(PUMA)的表达影响。方法利用SD仔鼠分离 NSCs，原代及传代培养，经氧糖剥夺(OGD)处理6 h后分为OGD+二甲基亚砜(DMSO)组和OGD+ PFT-α组，采用免疫印迹技术比较2组p53蛋白及PUMA的表达变化。体内实验中采用Longa法建立经CT证实的大脑中动脉栓塞模型大鼠48只，随机分为PFT-α+NSCs移植组(n=24)和DMSO+NSCs 移植组(n=24)；采用免疫荧光技术检测不同移植组中PUMA的表达。结果(1)体外实验中氧糖剥夺6 h后OGD+PFT-α组中p53蛋白入核水平下调，胞浆内表达上调，而OGD+DMSO组主要表达位于胞核；PUMA的表达水平明显低于OGD+DMSO组(P<0.05)；(2)体内实验中，与DMSO+NSCs组相比，PFT-α+NSCs移植组中PUMA表达阳性的细胞明显减少 [(38.9±4.3)% vs. (29.4±5.6)%，P<0.01]。结论PFT-α与神经干细胞联合应用后，可明显抑制PUMA的表达，这可能是PFT-α促进移植后神经干细胞在脑缺血区存活的重要机制。

PFT-α;p53下游促凋亡基因;神经干细胞；脑缺血；凋亡

干细胞移植治疗缺血性脑卒中是近年来研究的热点之一，具有广阔的应用前景。然而，干细胞移植后存活率较低成为限制其临床应用的主要障碍。Bliss等[1]研究证实p53基因在神经干细胞 (neural stem cells，NSCs) 中高表达，缺血性脑损伤可激活p53基因，进而发挥其促凋亡作用诱导细胞凋亡[2]。此外，在小鼠脑缺血模型中，应用p53的抑制剂能显著增加室管膜下层神经前体细胞的存活，增殖并抑制p53依赖的促凋亡基因表达[3]。有研究显示[4]，NSCs联合p53抑制剂(PFT-α)移植可显著提高移植后NSCs的存活，但机制尚不明确。p53上调凋亡调控因子(p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA)是 Yu 等[5]在2001年最早发现于结肠癌细胞中的一种促凋亡基因，因其可以被p53快速诱导并具有强大促凋亡作用而得名。近年来，PUMA已成为研究的热点之一，作为p53下游靶基因之一，PUMA 在p53依赖和非依赖的凋亡过程中均发挥了重要作用。然而，抑制p53表达后提高NSCs的存活是否与PUMA的表达有关罕有报道。本文旨在研究体内外条件下，应用PFT-α联合NSCs移植促进移植后的NSCs存活过程中PUMA表达水平的变化，为增加干细胞移植后的效果提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物: 选取体质量240～270 g的雄性SD大鼠48只，均由哈尔滨医科大学实验动物中心(动物合格证号：SCXK[黑]2013-001)提供。

1.1.2 主要试剂和仪器设备： CFMDA (Invitrogen 公司)，PFT-α (>98%，上海碧云天)，小鼠抗大鼠p53单克隆抗体(美国Abcam)，兔抗大鼠PUMA单克隆抗体(美国Abcam)。鼠脑立体定向仪 (上海Alcbio)，倒置相差显微镜 (日本，OLYMPUS IX-70)，激光共聚焦显微镜 (日本Fluoview 1000; Olympus)。

1.2 方法

1.2.1 NSCs的分离及鉴定： 参照Rietze等[6]和Chojnacki等[7]的方法，取新生24 h内的SD仔鼠，处死，将包含皮质及室管膜下区的脑组织移入离心管，反复吹打成单细胞悬液。尼龙网过滤,离心后向细胞沉淀内加入DMEM/F12神经干细胞完全培养液，吹散后按 2×106/cm2密度接种于6 cm培养皿，后置于37℃，5% CO2，饱和湿度条件下培养。每3～4天半量换液，每7～9天传代，细胞传至第3代后进行相关实验。

1.2.2 NSCs的氧糖剥夺处理： 取培养至第3代的神经球，以胶原酶(0.5 mg/ml)消化5～10 min后，制成单细胞悬液，按200 μl培养液含2×104/孔的细胞密度接种于96孔培养板。实验分组：(1)氧糖剥夺(OGD)+二甲基亚砜(DMSO)组：细胞应用OGD培养液替换正常培养液接种后，在37℃，5% CO2，1% O2，94%的N2条件下培养6 h。(2)OGD+ PFT-α组： 细胞在上述氧糖剥夺的条件下培养，并加入0～160 μmol/L浓度梯度的PFT-α。

1.2.3 大鼠大脑中动脉栓塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)建立及分组： 选取体质量240～270 g的雄性SD大鼠，参照Longa等[8]提出的线栓法建立大鼠可逆性大脑中动脉闭塞 (tMCAO)。头部CT证实模型建立均成功，随机分为:(1) PFT-α + NSCs移植组 (n=24)：大鼠移植的神经干细胞在移植前经PFT-α (10 μmol/L)预处理30 min，细胞移植后经腹腔途径给大鼠注射1次剂量的PFT-α (2 mg/kg)。(2) DMSO + NSCs 移植组 (n=24)：大鼠移植的神经干细胞在移植前经DMSO (10μmol/L)预处理30 min，细胞移植后经腹腔途径给大鼠注射1次剂量的DMSO (20 μl溶于1 ml 生理盐水)。

1.2.4 神经干细胞移植： 大鼠以10%水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔麻醉后，固定于立体定向仪上。以冠状点为中心以下列标识AP=1.0 mm, ML=+3.0 mm, DV=5.0 mm定位脑内移植位点。切开头皮，颅骨钻孔。微量注射器脑内注入2 μl含有3×106的神经干细胞，注射速度每分钟0.5 μl；注射后留针5 min拔针；拔针速度为每分钟<1 mm；大鼠接受细胞移植后严密观察3～6 h。

1.2.5 观测指标与方法：

1.2.5.1 免疫印迹技术 体外实验中,分离培养后的NSCs在氧糖剥夺条件下处理6 h后，收取蛋白样本，参照文献[9]转膜完毕后，放入5%的脱脂牛奶中封闭1 h，加入适当浓度的以3%BSA稀释的一抗兔抗大鼠PUMA单克隆抗体(1∶1 000)，4℃过夜孵育，TBS/T液洗膜6次，5 min/次；加入相应种属的二抗溶于5%的脱脂牛奶中(一般比例为1∶5 000)，室温孵育1 h，洗膜，应用ECL显影，在暗室曝光成像；应用Smart View凝胶成像系统分析条带灰度值。

1.2.5.2 免疫荧光染色 体内实验中，不同组实验动物在给予相应治疗后12 h，处死取脑，冻存切片备用。参照文献[10]将冰冻切片置入4%的多聚甲醛染色缸中固定30 min，PBS/T(0.1% Tween)漂洗和0.2%的Triton X-100(溶于PBS)穿透20 min，用PBS洗涤3次，用含1%BSA(10%山羊血清)的PBS封闭60 min。用含1%BSA的PBS稀释的小鼠抗大鼠p53单克隆抗体(1∶50)，山羊抗大鼠PUMA 单克隆抗体37℃培养箱内作用60 min，4℃孵育过夜。去除一抗，用PBS洗涤去除洗涤液，加入1%BSA稀释好的荧光二抗(1∶200)室温孵育60 min。PBS/T洗涤及染核后在荧光显微镜下观察。

1.3 统计学方法 应用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析。计量数据均以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PFT-α在体外对NSCs中PUMA表达的影响 体外条件下在氧糖剥夺处理6 h后，OGD+ PFT-α组限制了p53蛋白向细胞核内移位，P53主要位于细胞浆部分，使p53蛋白不能作为转录因子启动其依赖的促凋亡机制，而OGD+DMSO组p53主要位于细胞核部分(图1)；与OGD+DMSO组比较，OGD+PFT-α组神经干细胞中PUMA表达明显降低(P<0.05)(图2)，说明PFT-α在体外条件下作用神经干细胞后能够抑制PUMA蛋白的表达。

图1 免疫印迹法检测氧糖剥夺处理对神经干细胞中p53表达的影响

图2 免疫印迹法检测氧糖剥夺处理对神经干细胞PUMA表达的影响

2.2 PFT-α对NSCs移植后PUMA表达的影响 移植后12 h，神经干细胞中PUMA阳性细胞较常见(图3、4，见封3)，PUMA阳性细胞占移植神经干细胞的比率，PFT-α+ NSCs移植组为(29.4±5.6)%；DMSO+NSCs移植组为(38.9± 4.3)%，2组之间比较差异有统计学意义(P<0.01)；而在神经干细胞移植后24 h，很少有PUMA的表达。说明PFT-α与神经干细胞联合应用后早期，可明显抑制p53下游的促凋亡基因PUMA的表达，这可能是其促进神经干细胞移植后在脑缺血区存活的重要机制。

3 讨 论

近年的研究表明，在脑缺血损伤早期，p53会作为一个转录因子被激活，启动其下游的促凋亡基因如：p21、WAF、 Peg3/Pw1、Bax、 Noxa、PUMA等的转录表达，诱导神经细胞凋亡[11，12]。PUMA是2001年发现的p53靶基因，可以被p53快速诱导并具有强大促凋亡作用。近些年来研究表明不同脏器在缺血再灌注后，通过p53的激活，诱导PUMA的表达上调，诱导细胞经线粒体途径的凋亡。通过基因敲除技术去除PUMA基因后，DNA损伤诱导的p53依赖的凋亡显著减少[13]。PUMA基因敲除后的神经元，能够明显减少p53依赖的凋亡[14]。在实验性大鼠脑缺血模型实验中发现，在脑缺血发生4 h后，海马CA1区神经元的PUMA表达明显增多，在应用了p53抑制剂后，可明显减少这种PUMA的上调，减少神经细胞凋亡的产生[15，16]。这些研究说明，p53/PUMA通路在缺血再灌注损伤中的重要作用，可能成为缺血再灌注损伤防治的一个靶点。在本实验中，我们将神经干细胞移植于脑缺血区同时给予p53抑制剂，观察对移植于脑缺血区后神经干细胞中PUMA的影响，结果表明，在体外实验中，氧糖剥夺处理6 h后的神经干细胞在应用 p53抑制剂后，PUMA表达明显降低；体内实验中，PFT-α与神经干细胞移植联合应用明显抑制p53下游基因PUMA的表达，结果证实了p53抑制剂PFT-α对神经干细胞移植治疗脑缺血过程中p53诱导PUMA蛋白表达的抑制作用，从而抑制了移植于脑缺血区的神经干细胞凋亡，提高神经干细胞的存活，改善了干细胞移植效率，起到较好的治疗效果。由此可见PUMA在p53抑制剂促进神经干细胞存活过程中的关键作用。当然，其他的机制或是其他的促凋亡通路也可能参与到移植后神经干细胞凋亡过程中。在今后的研究中，多种抗凋亡方法的联合应用，可能是提高移植后干细胞存活的重要手段。

1 Bliss T,Guzman R,Daadi M,et al.Cell transplantation therapy for stroke[J].Stroke,2007,38(2):817-826.

2 Leker RR,Aharonowiz M,Greig NH,et al.The role of p53-induced apoptosis in cerebral ischemia: effects of the p53 inhibitor pifithrin alpha[J].Exp Neurol,2004,187(2):478-486.

3 Luo Y,Kuo CC,Shen H,et al.Delayed trea tment with a p53 inhibit or enhances recovery in stroke brain[J].Ann Neurol,2009,65(5):520-530.

4 雷旭辉,张平,蒋传路,等.抑制p53通路促进移植神经干细胞在脑缺血区的存活[J].中国微侵袭神经外科杂志,2014,19(3):129-131.

5 Yu J,Zhang L,Hwang PM,et al.PUMA induces the rapidapoptosis of colorectal Cancer cells[J].Mol Cell,2001,7(3):673-682.

6 Rietze RL,Reynolds BA.Neural stem cell isolation and characterization[J].Methods Enzymol,2006,4(19):3-23.

7 Chojnacki A,Weiss S.Production of neurons, astrocytes and oligodendrocytes from mammalian CNS stem cells[J].Nat Protoc,2008,3(6):935-940.

8 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

9 喻博,洪杨,陈亮宇,等.神经干细胞移植对脑损伤大鼠整合素表达的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2013,22(5):381-385.

10 高洪泉,王英,张爱清.银杏叶提取物对体外培养大鼠皮层神经干细胞缺糖缺氧/复糖复氧损伤的保护作用[J].神经解剖学杂志,2013,29(5):491-497.

11 Yonekura I,Takai K,Asai A,et al.p53 potentiates hippocampal neuronal death caused by global ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab,2006,26(10):1332-1340.

12 Lai XJ,Ye SQ,Zheng L,et al.Selective 14-3-3γ gamma induction quenches p-beta-catenin Ser37/Bax-enhanced cell death in cerebral cortical neurons during ischemia[J].Cell Death Dis,2014,5:e1184.

13 Ouyang YB,Xu L,Lu Y,et al.Astrocyte-enriched miR-29a targets PUMA and reduces neuronal vulnerability to forebrain ischemia[J].Glia,2013,61(11):1784-1794.

14 Hong LZ,Zhao XY,Zhang HL.p53-mediated neuronal cell death in ischemic brain injury[J].Neurosci Bull,2010,26(3):232-240.

15 Tsuchiya T,Bonner HP,Engel T,et al.Bcl-2 homology domain 3-only proteins Puma and Bim mediate the vulnerability of CA1 hippocampal neurons to proteasome inhibition in vivo[J].Eur J Neurosci,2011,33(3):401-408.

16 Niizuma K,Endo H,Nito C,et al.Potential role of PUMA in delayed death of hippocampal CA1 neurons after transient global cerebral ischemia[J].Stroke,2009,40(2):618-625.

StudyonregulatingofPFT-αtothePUMAinneuralstemcellstransplantationaftercerebralischemia

LIUYang,LEIXuhui,YINShi,JIANGChuanlu.

DepartmentofNeurosurgery,SecondAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,HeilongjiangProvince,Harbin150001,China

JIANGChuanlu,E-mail:jcl6688@163.com

ObjectiveTo explore the effect of p53 inhibitor (PFT-α) on neural stem cells after cerebral ischemia in p53 downstream apoptotic gene (PUMA) expression.MethodsUsing SD rat to isolate NSCs, through the primary and passage culture, by oxygen glucose deprivation (OGD) treatment for 6 h, they were divided into OGD+ dimethyl sulfoxide (DMSO) group and OGD+ PFT-α group, changes of expression of the p53 protein and PUMA by immunoblotting technique were compared between the 2 groups. In vivo tests using Longa method to establish the CT confirmed the brain artery embolism model in 48 rats, they were randomly divided into PFT-α+NSCs transplantation group (n=24) and DMSO+NSCs transplantation group (n=24) ; using immunofluorescence to detect the PUMA expression in the different groups of transplantation.Results(1) In vitro oxygen glucose deprivation after 6 h, OGD+PFT-α group’s p53 protein into the nucleus level decreased, expression is up-regulated in the cytoplasm, while OGD+DMSO group was mainly expressed in the cell nucleus; the expression level of PUMA was significantly lower than that in OGD+DMSO group (P<0.05); (2)In vivo experiment, compared with the DMSO + NSCs group, PFT-α+NSCs PUMA transplantation group’s positive expression cells was significantly reduced [(38.9±4.3)% vs. (29.4±5.6)%,P<0.01].ConclusionThe PFT-α combined with neural stem cells can inhibit the expression of PUMA, which may be an important mechanism of PFT-α to promote cell survival in the cerebral ischemic area after the transplantation of neural stem.

PFT-alpha; PUMA; Neural stem cells; Cerebral ischemia; Apoptosis

黑龙江省科学基金资助项目 (No.ZJY0604-02)

150001 哈尔滨医科大学附属第二医院神经外科

蒋传路，E-mail:jcl6688@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.11.017

2014-07-05)