响应面法优化黑木耳多糖与三价铬螯合工艺

尹红力， 王振宇,2*， 梁薇薇， 李婷婷， 刘 冉， 张乃珣

(1.东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨 150040;2.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨 150090)

响应面法优化黑木耳多糖与三价铬螯合工艺

尹红力1， 王振宇1,2*， 梁薇薇1， 李婷婷1， 刘 冉1， 张乃珣1

(1.东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨 150040;2.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨 150090)

[目的]优化黑木耳多糖和三价铬螯合工艺。[方法]采用分光光度法考察黑木耳多糖与三价铬的质量比、螯合时间、三价铬的初始浓度3个因素对其螯合率的影响，并通过Box-Behnken试验设计对试验数据进行二次响应面分析，优化黑木耳多糖与三价铬的螯合工艺。[结果]试验表明，木耳多糖与三价铬的最佳螯合工艺条件为：木耳多糖与三价铬的质量比为2.2∶1，螯合时间6.18 h，三价铬的初始浓度为5.96 mg/ml，在该条件下螯合率为41.56%。[结论]应用响应面法所得到的黑木耳多糖-铬(Ⅲ)螯合物的合成工艺参数是可行的，可为黑木耳多糖与三价铬螯合物的进一步开发利用提供参考。

黑木耳多糖；三价铬；螯合；响应面法

多糖(polysaccharide，简称PS)是一类具有广泛生物活性的生物大分子物质，目前已有300多种多糖类化合物从天然产物中被分离[1]。研究表明，黑木耳多糖具有许多重要的生理功能，如：降血糖[2-3]、降血脂[4-5]、抗肿瘤[6-7]、抗衰老[8]、提高机体免疫等功能。铬是目前研究较多且结论较为一致的一种重要的微量元素[9]，人体缺铬会导致一系列的代谢失常及病变[10-11]。大量研究表明，微量元素铬在糖尿病诊断、治疗及预防中有重要的作用[12-13]。

随着人们生活水平的提高，糖尿病成为危害人类健康的一大疾病，且发病率逐年上升，引起人们的广泛关注[14]。研究表明，多糖与金属离子的螯合物具有某些特殊的生理生化功能[15-16]，多糖螯合物不仅能够发挥黑木耳多糖的强大生理功能，同时能够作为一种金属补充剂，有降血糖[17]、补血、补锌等功效。目前已经报道了黑木耳多糖与Fe(Ⅱ)、Ze、Ag等螯合物的制备工艺[18-20]。铬在可食用领域的研究多数以蛋白质、多肽与铬螯合为主，少有多糖与铬进行螯合的相关报道[21]，笔者以东北地道黑木耳作为原料提取黑木耳多糖，充分发挥资源优势，并且与铬螯合，通过考察影响其螯合率的主要因素，并应用响应面法获得最佳提取工艺，为其在食品、医药、保健品等方面的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 黑木耳，黑龙江省海林市北味黑木耳。主要试剂：无水乙醇、氯化铬、硫酸、氢氧化钠、氯化钠，均为分析纯。主要仪器：恒温水浴锅， 上海普渡生化科技有限公司；精密pH计，广州三赢仪器公司；DHG-9240鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；UT-1810PC紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；JA2003电子天平，上海良平仪器仪表有限公司；PC20E-G电磁炉，上海奔腾企业有限公司；721分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；BCD-202GNS(E) 三星电冰箱，三星电器有限公司；RE-5205旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；TDL-40B-W台式低速大容量离心机，河南星科科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黑木耳多糖的提取方法。原料预处理→热水浴浸提(料液比1∶50 g/ml、提取温度为80 ℃、提取时间4 h)→离心(4 000 r/min，10 min)→上清液抽滤→浓缩→脱色→Sevage法除蛋白(氯仿∶正丁醇=4∶1；Savage试剂∶多糖溶液=1∶4)→醇沉过夜→离心→透析→冻干→多糖粗品。

1.2.2 三价铬溶液的配制。氯化铬溶液，分别称取2.562、3.074、3.587 g氯化铬分别溶于少量水中，移入100 ml容量瓶，加蒸馏水定容至100 ml，摇匀，分别配成5、6、7 mg/ml的三价铬溶液，储存于棕色瓶放置在冰箱中待用。磷酸溶液的配制：磷酸与水体积比是1∶3。

1.2.3 黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合物的合成与螯合率的测定。准确称取一定量的黑木耳多糖，加入待螯合的Cr(Ⅲ)溶液，置于振荡培养箱中，25 ℃，150 r/min，醇沉取上清液，旋转蒸发仪旋出乙醇，移取旋完后的上清液10 ml于25 ml锥形瓶中，加入5 ml磷酸，蒸馏水定容，分光光度计测量OD值，计算Cr(Ⅲ)的质量浓度。试验中的pH用稀硫酸或稀氢氧化钠调节[22]。

螯合率的计算公式：A(%)=(m0-m)/m0×100%

式中：A表示螯合率，m0表示螯合前溶液中Cr(Ⅲ)的质量(g)，m表示螯合后溶液中Cr(Ⅲ)的质量(g)。

1.3 三价铬标准曲线的绘制 准确称取0.500 g氯化铬，用蒸馏水溶解并定容至100 ml容量瓶中。配成1.95 mg/ml的三价铬溶液，分别按表1进行配置操作加样后，定容至25 ml。充分混匀后以管1为空白对照，600 nm波长下测各管的吸光度，绘制吸光度—三价铬含量曲线。

表1 铬标准溶液的配制 ml

从图1中可得,Cr(Ⅲ)的质量与吸光度值之间的线性关系为：y=0.011x-0.001，其中相关系数R2=0.999，符合要求。表明Cr(Ⅲ)在设定的浓度范围内与吸光值呈良好的线性关系，符合朗伯比尔定律，该方程可用于对Cr(Ⅲ)的定量测定。

图1 三价铬标准曲线

1.4 黑木耳多糖与三价铬螯合条件的单因素试验 设定pH为3，温度25 ℃，转速150 r/min，固定其他条件，分别考察多糖与三价铬的质量比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)、螯合时间(1、2、3、4、5、6 h)、三价铬初始浓度(1、2、3、4、5、6、7 mg/ml)对其螯合率的影响。

1.5 响应面法优化螯合工艺 根据单因素试验结果，以质量比、螯合时间、初始浓度3个因素为自变量，螯合率为响应值，进行3因素3水平响应面试验，使用MINITABL16软件，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，对黑木耳多糖与三价铬的最佳螯合工艺进行优化。试验因素与水平设计见表2。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 螯合时间对螯合率的影响。在150 r/min的条件下，Cr(Ⅲ)初始浓度为5 mg/ml，pH为3，黑木耳多糖与Cr(Ⅲ)的质量比为5∶1，常温下分别在1、2、3、4、5、6 h反应后取溶液，醇沉后，取上清液进行Cr(Ⅲ)含量的测定，计算螯合率，以此确定最佳螯合时间。

表2 响应面分析因素水平编码

由图2可知，螯合时间在1～5 h范围内，随着时间的增加，螯合反应就越加充分，黑木耳多糖与Cr(Ⅲ)的螯合作用也越彻底，螯合率逐渐增加。在时间达到5 h时得到最大值，螯合率为32.3%。故此单因素的最优螯合时间为5 h。

图2 螯合时间对螯合率的影响

2.1.2 Cr(Ⅲ)浓度对螯合率的影响。在150 r/min的条件下，Cr(Ⅲ)初始浓度分别为1、2、3、4、5、6、7 g/L，pH为3，黑木耳多糖与Cr(Ⅲ)的质量比为5∶1，常温下螯合2 h后取溶液，醇沉后，取上清液进行Cr(Ⅲ)含量的测定，计算螯合率，以此确定最佳螯合比例。

由图3可知，随着Cr(Ⅲ)浓度的增加，螯合率上升，当浓度为6 mg/ml时，螯合率达到最大，为38.45%。由此得出，Cr(Ⅲ)初始浓度为6 mg/ml时为最佳浓度。

图3 Cr(Ⅲ)浓度对螯合率的影响

2.1.3 黑木耳多糖与Cr(Ⅲ)的质量比对螯合率的影响。在150 r/min的条件下，Cr(Ⅲ)初始浓度为5 mg/ml，pH为3，黑木耳多糖与Cr(Ⅲ)的质量比分别为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，常温下螯合2 h后取溶液，醇沉后，取上清液进行Cr(Ⅲ)含量的测定，计算螯合率，以此确定最佳螯合比值。

由图4可知，在黑木耳多糖与三价铬的质量比为2∶1范围内时，随着比值的增加，螯合率有所上升，在质量比为2∶1时螯合率达到最大值，为35.50%。此后，随着黑木耳多糖质量的增加，螯合率降低。由此得出，质量比为2∶1时为最佳。

图4 黑木耳多糖与Cr(Ⅲ)的质量比对螯合率的影响

2.2 响应面法优化螯合条件结果 利用Box-Behnken试验设计，确定3因素3水平，共15个试验，见表3。其中12个析因点，3个零点。中心点重复试验用来估计试验误差， 以螯合物的螯合率为响应值做响应面试验，结果如表3所示。

表3 响应面分析方案及试验结果

将试验结果使用Design-Expert 7.0数理统计软件进行回归拟合，可得到响应值Y和各个因子(X1，X2，X3)之间的二次多元回归方程模型为：Y=2.061 3X1+2.931 2X2-0.140 0X3+1.110 00X1X2+1.027 50X1X3-0.407 500X2X3-8.833 33X12-1.218 33X22-6.160 83X32-254.809。

对表4回归分析数据进行方差分析可得：F回归=294.90,P回归=0.000;F线性=177.61,P线性=0.000;F平方=690.15,P平方=0.000;F交互=16.95,P交互=0.005;F失拟=3.57,P失拟=0.227。由此可知，黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合物的螯合率回归方程的失拟项P值大于0.05，且响应面模型的相关系数R2为0.998 1，说明模型的拟合度很好。因此，可用此回归模型代替真实的试验点进行分析，预测该螯合物的螯合率。由F检验值可以得出3个影响因素对螯合物螯合率的影响程度大小依次为：螯合时间>质量比>Cr(Ⅲ)初始浓度。关于3个影响因素的相互作用，由方差分析可知，RSM模型的一次项X1(P=0.000 0)、X2(P=0.000 0)和二次项X12(P=0.000 0)、X22(P=0.000 0)、X32(P=0.000 0)以及交互项X1X2(P=0.004)、X1X3(P=0.005)系数达到了极显著的水平，交互项X1X3(P=0.032 1)的系数显著，而X1X2(P=0.123)，X3(P=0.409)项系数不显著。

表4 响应面分析优化后模型的系数检验

注：R2=0.998 1。

根据回归分析做出各影响因素之间相互作用的响应面图(图5～7)，以确认黑木耳多糖与Cr(Ⅲ)的质量比(X1)、螯合时间(X2)和Cr(Ⅲ)的初始浓度(X3)3个因素对黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合率(Y)的影响。可知，黑木耳多糖与三价铬的质量比与螯合时间对黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)的螯合效果影响最大，Cr(Ⅲ)的初始浓度对螯合效果影响较小。依据回归模型的数学分析并综合响应图确定螯合的最佳工艺参数为：木耳多糖与三价铬的质量比为2.2∶1，螯合时间6.18 h，三价铬的初始浓度为5.96 mg/ml。

图5 质量比和Cr(Ⅲ)初始浓度交互作用对螯合率影响的等高线与响应面

图6 时间和Cr(Ⅲ)初始浓度交互作用对螯合率影响的等高线与响应面

图7 时间和质量比交互作用对螯合率影响的等高线与响应面

2.3 验证试验 回归模型预测的得率理论值为41.61%。为了验证模型的可靠性，采用上述优化条件进行黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合物的合成。在此条件下试验重复3次，3次平行试验的螯合率分别为41.33%、41.77%和41.59%，平均为41.56%，与理论预测值相比相对误差为0.01%，预测值与实际值接近。因此，通过响应面优化法得到的黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合物的合成工艺可以用来指导实际生产。

3 结论

根据单因素试验结果，采用响应面法对黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合物的合成反应条件进行优化，以分光光度法测定黑木耳多糖与三价铬螯合的螯合率作为评价指标，对各因素水平进行分析，得出黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)螯合物合成的优化条件为：黑木耳多糖与三价铬的质量比为2.2∶1，螯合时间为6.18 h，三价铬的初始浓度为5.96 mg/ml，在该条件下螯合率为41.56%。工艺验证试验表明，最优工艺条件可靠。目前国内外对黑木耳多糖-Cr(Ⅲ)的螯合物的研究尚没有明确的报道，因此该研究对于黑木耳多糖拓宽应用领域，及在食品、医药、保健品等方面的应用提供了一定的理论依据和数据支撑。

[1] 马宝瑕,陈新,邓军娥.中药多糖研究进展[J].中国医院药学杂志,2003,23(6):360-362.

[2] 宗灿华,于国萍.黑木耳多糖对糖尿病小鼠降血糖作用[J].食用菌杂志,2007(4):60-61.

[3] 韩春然,马永强,唐娟.黑木耳多糖的提取及降血糖作用[J].食品与生物技术学报，2006,25(5):111-114.

[4] 王献友,陈培云,吴广臣，等.黑木耳多糖提取及其药理活性的研究进展[J].南方农业学报，2012,43(5):683-687.

[5] 孙畅,姜明,段旭彤，等.黑木耳的保健和药用价值以及开发前景分析[J].科技视界，2012，5(1):17-18.

[6] MISAKI A,KAKUTA M.Studies on interrelation of structure and anti tumor effeets of polysaccharides: antitumor action of periodatemodifled branched(1-3)-β-D-glucan of Auricularia Auricula-judae,and polysaccharides confaining(l-3)glyeosidielinkages[J].Carbohydrate Researeh,1981,92:115-120.

[7] 黄滨南,张秀娟. 黑木耳多糖对人红白血病 K562 细胞周期和凋亡的影响[J].中成药，2010,32(5):727-730.

[8] 朱磊,王振宇.黑木耳多糖对小鼠抗疲劳作用的研究[J].营养学报,2008,30(4):430-432.

[9]朱定祥.保健食品中铬及其化合物的应用研究[J].广东微量元素科学,2009,16(3):11-15.

[10] 吴宪瑞,孔令员.黑木耳多糖的医疗保健价值[J].林业科技,1996,21(3):322-323.

[11] BUFFIE J C,ROBERTG U,JOHN B V.A comparison of the insulin sensitive transport of chromiumin healthy and model diabetic rats[J].Journal of Inorganic Biochemistry, 2004,98:522-533.

[12] CEFALU W T, HU F B. Role of chromium in human health and in diabetes[J].Diabetes Care,2004,27(11):2741-2751.

[13] 张瑞敬,陶成玉,罗云虎，等.血清中微量元素三价铬的含量与糖尿病的关系分析[J].微量元素与健康研究,2011,28(4):9-10.

[14] WILD S,TOGLIC G,GREEN A,et al.GIobal prevalence of diabetes;estimates for the year 2000 and projections for 2030[J].Diabetes Care,2004,27(5):1047-1053.

[15] 马利华,秦卫东,陈学红，等.金针菇多糖-Fe(Ⅱ)螯合物的制备及抗氧化活性[J].食品科学,2010,31(20):202-207.

[16] 赵兵,徐海清.枸杞多糖铁(Ⅲ)配合物的合成及理化性质的初步研究[J].中成药,2008,30(8):1245-1246.

[17] 邓毅,尹龙萍,赵爱华，等.黄芪多糖铬络合物的合成及其降血糖活性的初步研究[J].食品科学,2007,28(6):317-320.

[18] 赵鑫,周芳,王振宇.黑木耳多糖-银离子螯合物的制备工艺研究[J].中国林副特产,2011(2):7-9.

[19] 李公斌,王振宇.黑木耳多糖与Fe(Ⅱ)螯合物的制备工艺及红外光谱研究[J].食品工业科技,2006(5):136-138.

[20] 李公斌,王振宇,朱磊.黑木耳多糖与Zn(Ⅱ)鳌合物的制备工艺及红外光谱分析[J].东北林业大学学报,2006,34(3):66-89.

[21] YANG X, PALANICHAY K, ONTKO A C, et al. A newly synthetic chromium complex-chromium(phenylalanine) 3 improves insulin responsiveness and reduces whole body glucose tolerance[J].FEBS Letters,2005,579(6):1458-1464.

[22] 石德芝,李硕凡.分光光度法测定电镀液中的三价铬[J].广州化工，2009(6):98-101.

Study on the Optimization of ChelatingAuriculariaauricularPolysaccharides and Chromium(Ⅲ) by Response Surface Methodology

YIN Hong-li, WANG Zhen-yu et al

(Department of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; Department of Food Science and Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin, Heilongjiang 150090)

[Objective] Optimization ofAuriculariaauricularpolysaccharides and chromium(Ⅲ) chelate technology. [Method] The effects of three independent variables (the quality ofAuriculariaauricularpolysaccharides and chromium(Ⅲ), chelating time and chromium(Ⅲ) concentration of initial) with spectrophotometric method. And the chelation process were further optimized by response surface methodology (RSM) based on a Box-Behnken design. [Result] The results showed that the optimum extraction conditions were as follows: the quality ofAuriculariaauricularpolysaccharides and chromium(Ⅲ) is 2.2∶1, chelating time is 6.18 h. Chromium(Ⅲ) concentration of initial is 5.96 mg/ml. Under the optimized conditions, chelating rate is 41.56%. [Conclusion] It is feasible to optimize the chelation processing ofAuriculariaauricularpolysaccharides and chromium(Ⅲ). Given that, it could provide several references for further research on detection of it.

Auriculariaauricularpolysaccharides; Chromium(Ⅲ); Chelating; Response surface methodology

尹红力(1990- )，女，山东陵县人，硕士研究生，研究方向：功能性食品的研究与开发。*通讯作者，教授，博士，从事天然产物分离、功能性食品及生物活性材料研究。

2014-04-28

S 646.6

A

0517-6611(2014)15-04830-04