不同抗氧化剂对胎膜组织MMP-9表达的影响*

李 玲， 崔金晖， 陈新娟， 范建辉

(中山大学附属第三医院产科，广东 广州 510630)

胎膜早破(premature rupture of membranes，PROM)是指临产前的胎膜破裂，分为足月胎膜早破(term premature rupture of membranes，TPROM)和未足月胎膜早破(preterm premature rupture of membranes，PPROM)。其中PPROM占分娩量的1%～2%，占早产病因的30%～40%[1]，增加新生儿呼吸窘迫综合症、新生儿感染、脑室内出血、坏死性小肠结肠炎的发生率，文献报道有1%～2%的新生儿死亡[2]。并且PROM的潜伏期越长，孕妇的剖宫产率及绒毛膜羊膜炎的发生率均有增加趋势[3]。对于PROM，根据2013年ACOG最新指南[4]，临床的基本处理是终止妊娠或监测相关指标和促胎肺成熟期待妊娠至34周,尚无明确的预防和治疗方法。对于如何保护和治疗PROM尤其是PPROM显得尤为重要。研究表明，TPROM和PPROM胎膜组织、母血、羊水中基质金属蛋白酶 9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)表达高于正常足月妊娠组[5]。近几年国外对胎膜组织的体外培养研究表明抗氧化剂对胎膜组织具有一定的保护作用[6-8]。为探讨在体外抗氧化剂是否对破裂的胎膜组织也具有一定的保护作用，及比较不同抗氧化剂的保护强度，本实验体外培养破裂的胎膜组织，采用免疫组化染色法和Western blotting技术检测相应处理后胎膜组织MMP-9的表达量，进一步探讨和比较不同抗氧化剂对胎膜早破孕妇胎膜组织的作用。

材 料 和 方 法

1 研究对象

选取2013年在中山大学附属第三医院产科因PROM住院剖宫产分娩的孕妇(诊断标准参照2013年ACOG指南[4])，均未临产，其中TPROM(37～39周)和PPROM(28～37周)各4例(排除内外科合并症和外伤等诱因，孕妇要求剖宫产)。胎盘娩出后无菌操作下在宫颈破膜口处收集胎膜破裂组织3块，每块组织约3 cm×3 cm大小，用PBS冲洗去除血液和羊水，分别置于含DMEM培养基(5%双抗、0.2%水解乳蛋白)的无菌培养皿中培养(37 ℃、5%CO2)，3个培养皿中分别加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)(即对照组)、0.5 mmol/L α-硫辛酸(alpha-lipoic acid,α-LA)和28.8 g/L 维生素C(vitamin C，Vit C)+1.8 g/L维生素E(vitamin E，Vit E)体外培养24 h。培养后用PBS充分冲洗后每块胎膜组织分成两部分，一部分胎膜组织用甲醛固定，常规石蜡包埋备HE染色和免疫组化染色用，另一部分用液氮保存用于Western blotting的检测。

2 试剂和设备

2.1试剂 兔抗人MMP-9单克隆抗体(Abcam)，兔抗人β-actin单克隆抗体(Abcam)，羊抗兔多克隆抗体IgG HRP(Abcam)。PVDF膜(Millipore)，三步法SA-HRP兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒(北京康为世纪)。

2.2设备 Leica RM2025型石蜡切片机(Leica)；正置荧光显微镜(Leica)；Image-Pro Plus图片分析软件(Media Cybernetics)；聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(Bio-Rad)；凝胶图片曝光及分析仪AlphaView SA(Protein Simple)。

3 免疫组化对MMP-9的表达进行定位和半定量分析

各组中的胎膜组织经甲醛固定、脱水、透明及石蜡包埋后切片。切片脱蜡、乙醇复水、蒸馏水洗涤。3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶活性，EDTA 8.0修复液高压修复2 min，10%山羊血清室温封闭10 min。甩干后滴加兔抗人MMP-9单克隆抗体(稀释度为1∶30)，4 ℃孵育过夜(阴性对照由PBS代替I抗)。PBS冲洗后滴加生物素标记羊抗兔Ⅱ抗工作液常温孵育10 min，PBS充分冲洗，再滴加HRP标记的链霉亲和素工作液常温孵育10 min。PBS冲洗后二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色，双盲阅片，在光学显微镜下随机选取5个高倍视野(×400)，Leica显微镜摄像系统摄像，Image-Pro Plus图像分析系统测定阳性表达物的积分吸光度值(integral absorbance，IA)。以IA值(IA=阳性积分吸光度/阳性表达面积)代表MMP-9的表达水平。

4 Western blotting测定MMP-9的表达

应用碾磨体液氮下碾磨胎膜组织，蛋白提取液提取组织总蛋白。3组胎膜组织分别取总蛋白为80 μg，10%SDS-PAGE凝胶电泳，分离蛋白质，然后将蛋白转移至硝酸纤维素滤膜上,用5%脱脂奶粉封闭2 h。加入稀释度为1∶2 000兔抗人MMP-9单克隆抗体4 ℃过夜。以兔抗人β-actin(1∶1 000)作内参照。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体(稀释度为1∶2 000)，室温孵育1 h。洗涤后用新鲜配制的ECL化学发光液显影，AlphaView SA机自动曝光和进行条带灰度值扫描，扫描结果进行统计学处理,每例组织重复3次。

5 统计学处理

应用SPSS 13.0统计分析软件处理，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 免疫组化对各组胎膜组织中MMP-9表达的定位和半定量分析

1.1TPROM组织中各组MMP-9蛋白的表达 免疫组化结果显示，在TPROM组织中，分别加入PBS、α-LA和Vit C+Vit E后，3组中均有MMP-9的表达，主要表达于绒毛膜细胞及中性粒细胞的胞浆中。且3组棕黄色的阳性面积相差不大，IA值分别为：0.0133±0.0040、0.0077±0.0088和0.0071±0.0058,差异均无统计学意义(P>0.05)，见图1。

Figure 1. Localization of MMP-9 in TPROM tissues detected by immunohistochemical staining.

1.2PPROM组织中各组MMP-9蛋白的表达 免疫组化结果显示，在PPROM组织中，分别加入PBS、α-LA和Vit C+Vit E后，3组中均有MMP-9的强阳性表达，除在绒毛膜细胞和中性粒细胞胞浆中表达外，在羊膜上皮细胞的胞浆中也表达。且加入抗氧化剂后MMP-9的表达量均出现下调，以Vit C+Vit E组最显著。3组的IA值分别为0.0618±0.0098、0.0212±0.0057和0.0107±0.0009，组间差异显著(P<0.01)，见图2。

Figure 2. Localization of MMP-9 in PPROM tissues detected by immunohistochemical staining.

2 Western blotting对各组胎膜组织中MMP-9蛋白表达的定量分析

2.1TPROM组织中各组MMP-9蛋白的表达 Western blotting结果显示，在TPROM组织中，分别加入PBS、α-LA和Vit C+Vit E后，3组中的pro-MMP-9(92 kD)和active MMP-9(78 kD)蛋白的相对表达水平分别为0.99±0.03/0.99±0.22、0.94±0.07/0.64±0.07和1.10±0.16/0.28±0.13。加入抗氧化剂后active MMP-9表达量均出现下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。且Vit C+Vit E组和α-LA组比较，前者active MMP-9表达量更低，差异有统计学意义(P<0.05)。3组中pro-MMP-9(92 kD) 的表达量差异均无统计学意义(P>0.05)，见图3。

Figure 3. Protein levels of MMP-9 in TPROM tissues detected by Western blotting.Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs control；△P<0.05 vs α-LA.

2.2PPROM组织中各组MMP-9蛋白的表达 Western blotting结果显示,在PPROM组织中，分别加入PBS、α-LA、Vit C+Vit E后，3组中的pro-MMP-9和active MMP-9蛋白的相对表达水平分别为1.00±0.20/1.00±0.10、0.69±0.08/0.35±0.07和0.38±0.03/0.16±0.05。加入抗氧化剂后pro-MMP-9和active MMP-9蛋白表达量均出现下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。且Vit C+Vit E组与α-LA组比较，前者pro-MMP-9和active MMP-9表达量更低(P<0.05)，见图4。

Figure 4. Protein levels of MMP-9 in PPROM tissues detected by Western blotting.Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs control；△P<0.05 vs α-LA.

讨 论

胎膜早破的发病是多因素、多途径共同相互作用的结果。现在的研究一致认为胎膜本身结构的改变是胎膜早破发生的中心环节[9]，而组成胎膜细胞外基质的各种胶原蛋白是维持胎膜的强度及完整性的主要决定因素,其中Ⅰ型和Ⅳ型胶原蛋白在基底膜和细胞外基质中占有重要地位。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)被激活后能降解细胞外基质的胶原蛋白成分，研究最多的是MMP-2和MMP-9[10]，MMP-2和MMP-9主要降解Ⅳ型胶原蛋白。研究发现[11-13]足月妊娠中胎膜破裂处的MMP-9蛋白的表达及活性均比未临产宫颈处的MMP-9明显升高，且分娩发动后羊水中MMP-9活性也明显升高，PROM患者MMP-9在宫颈处胎膜中的浓度也比其它地方高，且胎膜组织中IV型胶原含量下降明显，与MMP-9的上升具有相关性，提示MMP-9不仅参与了正常分娩过程中胎膜的破裂，也参与了胎膜早破的发生。既往大量的研究，学者一直提出胎膜早破与ROS相关的学说。在与胎膜早破相关的病因中，感染、Vit C缺乏、出血、吸烟、可卡因的使用[14]，均与活性氧(reactive oxygen species，ROS)密切相关。马秀菊等[15]和肖文霞等[16]做了大量的关于胎膜早破和氧化应激的研究，发现胎膜早破孕妇血清、蜕膜组织、胎膜组织中氧化应激指标丙二醛升高，超氧化物歧化酶、Vit E均降低。PPROM孕妇的血清Vit C浓度也比正常孕妇低[17]，提示Vit C可能参与了PPROM的发生。如果PROM和ROS存在密切的关系，抗氧化剂应该能够对这种氧化应激的连锁反应起一定的阻断作用。研究表明[6-8]，体外实验发现抗氧化剂能够抑制凝血酶、TNF-α、HOCl对胎膜组织的损伤。动物实验也发现鸟类每天口服300 mg/kg α-LA后，血清、肝脏以及肌肉中脂质过氧化物标志物丙二醛的浓度较对照组显著降低，提高体内的抗氧化能力和抑制氧化应激反应[18]。既往大量的研究在于发现抗氧化剂能够预防胎膜组织的损伤，本实验在此基础上进一步探讨抗氧化剂对破裂的胎膜组织是否也具有保护和治疗作用？本实验采用28.8 g/L Vit C+ 1.8 g/L Vit E的剂量是根据动物实验在缺氧环境下能够保护胎儿心脏的剂量[19]，而0.5 mmol/L α-LA是能够保护体外培养的胎膜组织减少受TNF-α和IL-1β损伤的剂量[6]。本研究Western blotting结果显示破裂的胎膜组织加入抗氧化剂α-LA或Vit C+Vit E后， active MMP-9的表达量均下调，在PPROM组织中，pro-MMP-9的蛋白表达也出现了明显的下调(P<0.05),结果进一步说明了体外抗氧化剂对胎膜组织有保护作用。

上述研究的结果均提示胎膜早破和氧化应激有密切的联系，抗氧化剂不仅能够预防胎膜组织的损伤，还能够对破裂的胎膜组织也具有一定的保和治疗作用。胎膜早破发生后，ROS仍存在连锁的瀑布式反应，及时给予抗氧化剂后可清除ROS，减少凝血酶、TNF-α和细胞因子等的分泌，减少MMP-9的活化和细胞外Ⅳ型基质胶原蛋白的破坏和降解，避免胎膜组织进一步的重构和变性，有利于破膜处伤口的愈合。本实验结果表明在0.5 mmol/L α-LA或28.8 g/L Vit C+ 1.8 g/L Vit E的作用剂量下， Vit C+Vit E的保护和治疗作用强于α-LA(P<0.05)。因为Vit C与α-LA相比较，除具有抗氧化性能外，还参与胶原蛋白的合成及分泌，Vit C是合成赖氨酸羟化酶和脯氨酸羟化酶的辅因子，对于维持胶原蛋白三维螺旋结构稳定的羟赖氨酸和羟脯氨酸的合成至关重要[20]。Vit C还具有促进Vit E循环利用的功能，具有协同作用。Vit E的主要作用是预防细胞内外脂质过氧化作用，减少ROS对膜的损伤。Vit C和Vit E同时使用的效果更优于Vit C的单独使用。

本实验还采用了免疫组化染色方法对MMP-9蛋白进一步定位, TPROM组织中MMP-9主要定位于绒毛膜细胞和中性粒细胞的胞浆中，PPROM组织中MMP-9除在绒毛膜细胞和中性粒细胞的胞浆中表达外，在羊膜上皮细胞的胞浆中也强阳性表达，提示PPROM组织损伤更为严重，MMP-9表达更为广泛。免疫组化对MMP-9的半定量分析结果和Western blotting结果基本相一致。免疫组化结果中，在TPROM胎膜组织中3组间MMP-9(pro-MMP-9和active MMP-9)差异无统计学意义(P>0.05)，可能因为pro-MMP-9表达无显著差异导致MMP-9(pro-MMP-9和active MMP-9)差异无统计学意义。

综上所述，本实验结果进一步证实胎膜早破和ROS的密切相关，抗氧化剂对于破裂的胎膜组织也具有一定的保护和治疗作用，但具体的作用机制尚需要进一步研究和临床实验的证实。28.8 g/L Vit C+ 1.8 g/L Vit E的保护作用明显优于0.5 mmol/L α-LA，可能与Vit C参与胶原蛋白的合成相关，也有可能与α-LA的剂量不够有关。至于具体多大剂量的α-LA和Vit C+Vit E才能够更好地预防和治疗胎膜早破以及α-LA+ Vit C+Vit E联合用药是否会发挥更好的作用有待进一步的研究。

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