脂多糖通过PI3K/Akt/mTOR通路调控巨噬细胞自噬*

杜 涛， 黄 海， 陈 欣， 丁 红， 张 睿， 刘梅兰， 陈 慧

(中山大学孙逸仙纪念医院妇产科，广东 广州 510120)

巨噬细胞是胚胎免疫耐受的核心细胞，流产患者中巨噬细胞的增多并活化是导致流产的主要因素之一[1]。自噬是溶酶体对自身结构的吞噬降解，它既是细胞内的再循环系统，也是机体一种重要的防御和保护机制。在生理状态下，自噬作为机体的一种防御机制，在母体对胚胎免疫耐受的发病机制中具有十分重要作用[2]。自噬在对中枢免疫耐受的诱导中起到关健作用。因此研究母体中巨噬细胞的自噬情况及其调控机制对自然流产的发生具有深远意义。本研究拟通过体外实验利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激巨噬细胞，同时检测巨噬细胞自噬情况及其经典PI3K/Akt/mTOR调控通路，对流产中母体巨噬细胞自噬的机制进行初步探讨。

材 料 和 方 法

1 材料

RPMI-1640培养基和胎牛血清(HyClone)；0.25%胰酶(吉玛公司)；3-磷酸甘油醛脱氢酶(gly-ceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体(Santa)；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记羊抗兔抗体(ICL)；BCA法蛋白定量试剂盒(上海申能博采)；柯达黑白胶片；增强化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)试剂盒(Thermo),超敏ECL试剂盒(Millipore)。

2 方法

2.1实验分组 将巨噬细胞体外培养，共分为5组，分别检测不同状态下巨噬细胞的自噬情况以及PI3K/Akt/mTOR通路激活状态；分别从PI3K及mTOR水平阻断PI3K/Akt/mTOR通路，检测巨噬细胞自噬，明确巨噬细胞自噬与PI3K/Akt/mTOR之间的关系。A组：单纯小鼠巨噬细胞系RAW264.7 细胞；B组：Earle’s平衡盐溶液培养的巨噬细胞(饥饿状态，激活自噬)；C组：LPS刺激的巨噬细胞；D组：LPS刺激后的巨噬细胞+PI3K抑制剂(hVps34)；E组：LPS刺激后的巨噬细胞+mTOR抑制剂(雷帕霉素)。

2.2各组巨噬细胞体外培养 小鼠巨噬细胞系RAW264.7 细胞购自American Type Tissue Collection(ATCC)，常规传代培养，培养基采用含10%胎牛血清的DMEM。C组用LPS刺激巨噬细胞，浓度为1 μg/L。D组和E组分别加入hVps34和雷帕霉素阻断PI3K/Akt/mTOR通路。

2.3稳定表达GFP-LC3的RAW264.7细胞系的建立 构建pcDNA3.1-GFP-LC3真核表达载体，应用转染技术将该质粒导入RAW264.7细胞，用G418筛选稳定表达的细胞系。真核细胞中GFP-LC3的表达分别用荧光显微镜检测，并利用该稳定表达细胞系观察内质网应激时细胞发生自噬的情况。

2.4检测各组巨噬细胞自噬情况

2.4.1用qRT-PCR方法检测细胞自噬相关基因的mRNA表达水平 qRT-PCR采用的是LightCycler Real Time PCR扩增仪。用TRIzol从细胞内提取总RNA。然后用SuperScript试剂盒合成cDNA。Atg5上游引物5’-TTGACGTTGGTAACTGACAAAGT-3’,下游引物5’-TGTGATGTTCCAAGGAAGAGC-3’;Atg7上游引物5’-GATCCGGGGATTTCTTTCACG-3’,下游引物5’-CAGCAGCTTGGGTTTCTTGAT-3’;LC3-Ⅱ上游引物5’-GATGTCCGACTTATTCGAGAGC-3’,下游引物5’-TTGAGCTGTAAGCGCCTTCTA-3’;Bnip3上游引物5’-TGGACGGAGTAGCTCCAAGAG-3’,下游引物5’-CCGACTTGACCAATCCCATATC-3’。

预变性：95 ℃ 30 s；PCR反应： 95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循环40次；熔解曲线分析：95 ℃ 1 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 5 s。反应结束后确认扩增曲线和熔解曲线。

2.4.2在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白示踪自噬形成 由于电镜耗时长，不利于监测自噬形成过程，我们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象对此进行观察。无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

2.4.3利用Western blotting检测LC3-II、p-Akt和p-mTOR的表达 将5组细胞培养后，吸除培养基，冰上RIPA 按70 μL/well，PMSF 按RIPA 的1/100 加入，冰上裂解30 min。刮取裂解细胞于4 ℃、14 000 r/min离心30 min，取上清为细胞总蛋白。BCA 法蛋白定量，于12%SDS-PAGE 行细胞蛋白电泳，转于PVDF 膜上，剪取目的条带，5%脱脂奶封闭3 h，分别孵LC3-II、p-Akt和p-mTORⅠ抗过夜，第2天孵HRP 标记Ⅱ抗1 h，暗室中加入发光液，黑白胶片曝光。所得到免疫印迹的定量可以用Bio-Rad提供的Molecular Analyst software进行灰度分析。计算LC3-II、p-Akt、p-mTOR和内参照GAPDH比值，评价自噬形成及mTOR通路激活情况。

3 统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示，计量资料采用单因素方差分析或者Kruskal-Wallis检验；统计分析软件使用SPSS 17.0。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 稳定表达GFP-LC3的RAW264.7细胞系的建立

构建pcDNA3.1-GFP-LC3真核表达载体，应用转染技术将该质粒导入RAW264.7细胞，用G418筛选稳定表达的细胞系。真核细胞中GFP-LC3的表达用荧光显微镜检测，如图1所示，可见RAW264.7细胞稳定表达GFP-LC3并在蓝光照射下发出绿色荧光。

2 检测各组巨噬细胞自噬情况

2.1用qRT-PCR方法检测细胞自噬相关基因的mRNA表达水平 如图2所示，在5组细胞中，自噬相关基因的表达存在明显差异，在饥饿状态下巨噬细胞均处于自噬激活状态，自噬相关基因Atg5、Atg7、LC3-II和Bnip3的mRNA表达均上升；在LPS刺激下，巨噬细胞的自噬处于抑制状态，与对照组比，Atg5、LC3-II和Bnip3存在显著差异，但是Atg7的mRNA水平与对照组没有明显差异；加入PI3K抑制剂(hVps34)和mTOR抑制剂(雷帕霉素)后，巨噬细胞的自噬明显处于激活状态，与对照组相比，Atg5、 Atg7、LC3-II和Bnip3的mRNA表达均上升。

Figure 1. pcDNA3.1-GFP-LC3 transfected into RAW264.7 cells (×200).A:fluorescence; B: phase-contrast; C: merged.

Figure 2. The mRNA expression of Atg5, Atg7, LC3-II and Bnip3 in each group. Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

2.2在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成 如图3所示，将GFP-LC3融合蛋白转入巨噬细胞后，在荧光显微镜下可以观察自噬体的形成。单纯巨噬细胞组中GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中，很少形成代表自噬体的荧光斑点；Earle’s平衡盐溶液中巨噬细胞处于自噬激活状态，可见自噬体形成；LPS组虽然有自噬体形成，单荧光强度低于Earle’s平衡盐溶液组；另外2组均可看到较多自噬体的形成，LPS+雷帕霉素组最明显。除了LPS组与对照组之间没有明显差异外，其它各组荧光强度与对照组之间存在明显差异。

2.3利用Western blotting检测LC3-II、p-Akt(Ser473)和p-mTOR(Ser2448)的变化 如图4所示，p-Akt(Ser473)在Earle’s平衡盐组、LPS组和LPS+雷帕霉素组中表达明显升高；p-mTOR(Ser2448)在Earle’s平衡盐组、LPS+hVps34组和LPS+雷帕霉素组表达明显下降；LC3-II的表达在Earle’s平衡盐组、LPS+hVps34组和LPS+雷帕霉素组中表达要高于对照组和LPS组。阻断mTOR后，巨噬细胞自噬增强，这与文献报道相同，mTOR对细胞自噬起到负调节作用。阻断PI3K后，在LPS共同作用下，Akt磷酸化水平下降明显，但是巨噬细胞自噬水平并没有下降，这与文献报道不符，应该存在其它相关通路对自噬进行调控。

讨 论

在免疫网络中巨噬细胞既是免疫效应细胞，又是免疫调节细胞[3-4]。(1)正相调节作用：体内的巨噬细胞一般处于静止状态，当受到某些因素如病原体等异物或细胞因子等刺激后活化，活化的巨噬细胞功能明显增强，不但吞噬各种病原体，杀伤肿瘤细胞，而且还向 T 细胞提呈抗原，分泌细胞因子参与免疫应答，该作用称为免疫正相调节作用。(2)负相调节作用：巨噬细胞中还存在一种抑制性巨噬细胞，分泌多种可溶性抑制物如前列腺素、活性氧分子等抑制淋巴细胞增殖反应或直接损伤淋巴细胞，该作用称为免疫负相调节作用。抑制性巨噬细胞经 LPS 刺激后发生免疫调节成为新型巨噬细胞，分泌 IL-1、IL-2、PGE 增加，能够增强 T、B 淋巴细胞及 NK细胞活性，并保持或增强抗肿瘤效应[5]。(3)体内各种因素通过调控巨噬细胞功能状态而发挥免疫调节作用。多种神经肽及激素样物质如 P 物质、皮质激素、性激素等均可通过相应受体而调控巨噬细胞的功能状态；另外，某些神经肽与细胞因子(如 IL-1、TNF-α、IFN-γ)可诱导巨噬细胞 MHC-Ⅱ类抗原的表达，从而调控其抗原呈递功能[6]。

巨噬细胞是调控母体免疫状况产生免疫耐受的重要细胞，从而决定胚胎是否可以免受免疫打击而流产[7-9]。巨噬细胞是天然性免疫和获得性免疫的桥梁，通过识别并耐受胚胎抗原直接影响妊娠结局，巨噬细胞的功能异常是导致母胎耐受异常、流产发生的重要原因[10-12]，研究已经证明在流产的动物模型及临床标本中巨噬细胞均处于活化状态。因此明确巨噬细胞功能状态对了解流产有重要意义。

Figure 4. Expression of LC3-II, p-Akt and p-mTOR tested by Western blotting.Lane 1: control group; Lane 2: starvation group; Lane 3: LPS group; Lane 4: LPS+PI3K inhibitor (hVps34) group; Lane 5: LPS+mTOR inhibitor (rapamycin) group. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs LPS.

细胞自噬是溶酶体对自身结构的吞噬降解，它既是细胞内的再循环系统，也是是机体一种重要的防御和保护机制。巨噬细胞自噬状态可以影响其具体功能。巨噬细胞可以通过自噬与溶酶体结合，消除、降解和消化受损、变性、衰老和失去功能的细胞、细胞器以及变性蛋白质与核酸等生物大分子。这种机能为细胞的重建、再生和修复提供必须原料，实现细胞内资源的再循环和再利用。在生理状态下，自噬作为机体的一种防御机制，在母体对胚胎免疫耐受的发病机制中具有十分重要作用。自噬在对中枢免疫耐受的诱导中起到关健作用。首先，自噬相关基因Atg5缺陷的胸腺移植可导致自身反应性CD4+T细胞的产生[13]；其次，自身免疫性肠病——克罗恩氏病的发生部分归因于自噬相关基因Atg16L1的多态性[14]。然而，自噬在外周免疫耐受中的作用，目前尚无直接可用的实验数据对其论证，但存在一些间接证据可以对其佐证。例如：来源于自噬相关基因Atg16L1缺陷的巨噬细胞经内毒素刺激后可产生更多的前炎症细胞因子(IL-1β和IL-18)[15]。因此，自噬状态关系到巨噬细胞的功能，在流产孕妇中间接关系到免疫状态，从而对胎儿产生影响。

mTOR是调节细胞生长和增殖的重要因子，在与营养分子有关的信号转导、蛋白质翻译调控、细胞周期进展等过程中都占据重要地位；同时，它也是自噬启动阶段的关键调节因子，活化后可抑制自噬发生[16-17]。启动阶段的靶点主要为mTOR相关靶点，包括TOR 复合体1 (TOR complex 1， TORC1)和Ⅰ型PI3K。(1) TORC1：mTOR由2个独立的复合体-TORC1和TORC2构成。细胞内生长因子的信号及能量水平和营养状态的信息会通过Ⅰ型PI3K和Akt/PKB通路传递给TORC1，并在达到适当的水平时导致TORC1活化，从而激活mTOR，使自噬受到抑制。故而，可通过调节TORC1 的活性来影响mTOR的活性，进而调节细胞自噬的活性。最经典的自噬相关药物-雷帕霉素的作用靶点即为TORC1[18]。我们的实验证实，加入雷帕霉素后巨噬细胞中的自噬明显增强。(2) Ⅰ型PI3K：活化的生长因子受体可通过直接结合的方式来激活下游的Ⅰ型PI3K；也可通过生长因子受体结合蛋白2 (growth factor receptor-bound protein 2, GRB2)和SOS (Son of sevenless) 介导激活Ras，再由Ras间接激活Ⅰ型PI3K。但无论采用哪种方式, 激活Ⅰ型PI3K从而触发mTOR通路是必不可少的环节，因而通过对Ⅰ型PI3K的调控就可起到对自噬进行调控的作用。我们加入经典的自噬抑制药物hVps34后，巨噬细胞的自噬并没有明显下降，这证明LPS对巨噬细胞的作用还存在其它的信号通路。LPS刺激巨噬细胞后，通过免疫荧光及Western blotting均可检测到巨噬细胞的自噬有所增加，考虑是外界因素刺激巨噬细胞后，细胞本身产生的保护机制。而加入hVps34后，细胞内自噬反而增加主要因为抑制了传统自噬调控通路mTOR后，侧枝通路调控加强所引起，同时协同LPS对细胞的Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)的激活，各方效果叠加后巨噬细胞的自噬反而增强。因此，LPS可以调控巨噬细胞的自噬，其可能的调控通路为PI3K/Akt/mTOR通路，但这不是唯一通路。

[参 考 文 献]

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