卡托普利对AGS胃癌裸鼠移植瘤模型的调控作用*

李 力， 金震东， 蔡 敏， 王 斌， 程烽涛

(1第二军医大学附属长海医院消化内科，上海 200433； 2上海杨浦区中心医院消化内科，上海 200090)

胃癌是常见高发恶性肿瘤之一，且死亡率居高不下[1-2]。胃癌的化疗药物研发周期长、耗资大风险高，致使目前新药的研发进展较为缓慢，所以既能够避免新药研发耗时又能够保障安全性的“老药新用”就成为了现在临床药品研发的一大关注热点。血管紧张素转换酶抑制剂卡托普利(captopril)已临床应用多年，具有较好的安全性，长期应用对多种肿瘤的发生有抑制作用[3-4]。但是，到目前为止，关于卡托普利对胃癌的治疗作用尚无报道，因此探索卡托普利在胃癌患者中的可行性具有重要的临床价值。本研究将首次从体内实验角度观察卡托普利对胃癌的治疗作用，并初步探讨其临床治疗的可行性及机制。

材 料 和 方 法

1 主要实验材料

裸鼠(由上海斯莱克动物中心提供)，人胃癌细胞株AGS(中国科学院上海生科院细胞资源中心)，卡托普利(Sigma)，实验所需各检测指标抗体均购于Abcam，Trizol(Invitrogen),real-time检测仪(ABI-7300)，荧光显微镜(CX41，Olympus)，IMS图像分析系统(基尔顿生物科技上海有限公司)。

引物序列：Ki-67 上游引物5’-TGGCCTACCTGGTCTTAGTTC-3’，下游引物5’-TCCTCTTGGTTGGCGTTTC-3’；信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)上游引物5’-GACTCAAAGCCACCTCATTC-3’，下游引物5’-GCCTTGCCTTCCTAAATACC-3’;Bax上游引物5’-TAGCAAACTGGTGCTCAAGG-3’,下游引物5’-AGCCACAAAGATGGTCACTG-3’；Bcl-2上游引物5’-CATGCACCAAGTCCAGTACAG-3’,下游引物5’-TACAGGCATTGCCGCATAG-3’；GAPDH上游引物5’-ATCACTGCCACCCAGAAG-3’,下游引物5’-TCCACGACGGACACATTG-3’。

2 方法

2.1模型制作及分组

2.1.1动物 BALB/c裸鼠，5～6周龄，雄性，SPF级。

2.1.2AGS肿瘤细胞皮下注射法动物模型制作 将足够体外培养肿瘤细胞在对数生长期用0.25%胰酶消化后洗出，最后加入PBS或0.9%NaCl注射液制成1×1010/L，镜下计数，并观察活细胞数在95%以上。一次性注射器抽取混匀的细胞悬液0.2 mL，左手固定小鼠偏右侧，皮肤消毒后，从小鼠侧面肋骨缘处进针至腋窝皮下，推入细胞悬液，缓缓拔出针头，用针横推皮下液体，使其固定在腋窝部位，可使肿瘤生长较圆整。给予纯净水，标准饲料，屏障系统内IVC隔离笼具饲养。

2.1.3分组 将裸鼠随机分为3组，每组各15只，分组情况如下：阳性对照(5-氟尿嘧啶，5-fluorouracil,5-Fu)组、对照(生理盐水)组和卡托普利干预组。

2.2处理 阳性对照组给予5-Fu腹腔注射，剂量为(0.6 mg/只),卡托普利干预组给予卡托普利灌胃，剂量为(2.8 mg/只)，实验开始后每天观察裸鼠的生存质量并注意是否出现死鼠[5]。干预31 d后，无死鼠，取肿瘤组织进行后续实验。

2.3检测方法 将所取组织经脱水-石蜡包埋-切片后进行下列实验：(1)采用实时荧光定量PCR、Western blotting以及免疫组化检测Ki-67、STAT3、Bax、Bcl-2和磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3,p-STAT3)表达；(2)TUNEL+DAPI染色法：对组织切片显微镜下观察并拍照，检测细胞凋亡。

3 统计学处理

用SPSS 17.0软件分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间差异采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 肿瘤生长情况

造模成功后，各组小鼠均出现差异不明显的肿瘤结块。随时间推移，对照组裸鼠肿瘤块较其它2组明显生长加快，卡托普利组居中，5-Fu组最慢。到第14天各组差异开始明显加大(P<0.05)，变化趋势如图1所示。

Figure 1. Growth of the tumor.Mean±SD.n=15.*P<0.05 vs conrtol； #P<0.05 vs 5-Fu.

2 Tunel+DAPI染色结果

TUNEL+DAPI结果显示，5-Fu组以及卡托普利组的组织癌细胞凋亡率[(21.45±0.11)%和(37.57±0.13)%]较对照组[(11.10±0.05)%]有明显上升(P<0.05)。卡托普利组凋亡率最高，与5-Fu组比较差异显著(P<0.05)，见图2。

3 实时荧光定量PCR检测结果

由Real-time结果(图3)可以看出，各组药物干预31 d后，各相关因子mRNA表达量均有不同程度变化，其中，卡托普利组Bax相较于对照组有明显上升，而STAT3、Ki-67以及Bcl-2的表达则呈下调趋势(P<0.05)。5-Fu组与卡托普利组各相关因子表达趋势相一致，但2组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

4 免疫组化结果

相较于对照组，卡托普利组Bax表达明显上升，而Ki-67、STAT3以及Bcl-2的表达下降(P<0.05)。卡托普利组各因子表达趋势与5-Fu组表达趋势一致，但2组间差异显著(P<0.05)。免疫组化结果与PCR检测结果吻合，见图4、表1。

5 Western blotting检测结果

5-Fu组和卡托普利组p-STAT3和STAT3蛋白表达均较对照组明显降低(P<0.05)，见图5。

讨 论

研究发现，肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)在癌症发生的各个阶段都起着极为重要的作用，但机制未被明确阐述。目前RAS系统抑制剂——血管紧张素II(angiotensinⅡ，AngⅡ)抑制剂作为抗癌药的研究受到众多关注，但其对胃癌的应用研究尚少。血管紧张素转化酶抑制剂一直以来主要作为降压药品被广泛应用。近年来，该类药物的抗肿瘤作用日益受到众多学者们的关注并进行了相关的研究。本实验研究以AGS裸鼠胃癌模型为研究对象，通过观察检测使用血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利治疗后裸鼠肿瘤相关因子的变化，来判断并推测卡托普利在胃癌治疗应用方面的可行性并初步探索其作用机制。本研究发现，药品干预31 d后，肿瘤细胞凋亡率较对照组有明显升高(P<0.05)，可见卡托普利在胃癌治疗方面具有一定可行性。通过肿瘤相关因子Ki-67、STAT3、p-STAT3、Bax和Bcl-2的检测发现，这些因子在卡托普利干预的同时有着相应的趋势变化，推测可能在干预过程中，卡托普利直接或间接调控或者影响肿瘤相关因子，从而达到抑制肿瘤细胞生长或诱导其凋亡的目的。到目前为止，研究发现卡托普利不仅具有抑制细胞凋亡的作用[6-7]，还能够诱导细胞的凋亡[8]，曾有人推测这2种截然不同的结果可能是由细胞类型、卡托普利用药量以及病理状态所决定的[9]，还有研究表明，Ang Ⅱ能够调节生长因子促血管发生，它可能是通过血管紧张素II 1型受体(angiotensin II type 1 receptor, AT1R) 下调血管生成作用[10-12]。亦有研究表明，ACEI类药品可能通过AngⅡ-AT1R途径减少血管的发生及肿瘤的生长转移[13]。STAT3作为信号转导及转录活化家族的重要成员，广泛表达于各种类型的细胞以及组织当中，它的持续激活可导致细胞异常增殖与恶性转化，被认为是癌基因的一种[14]。研究证明，它并不直接介导肿瘤的发生，而是通过对其下游靶基因(如Bcl-2、Bax等)的调控来影响肿瘤的进程，且STAT3蛋白表达与血管内皮生长因子蛋白之间也具有显著相关性[15]。STAT3以及它的活化形态p-STAT3在肿瘤细胞的侵袭和转移中也起着一定作用[16]。STAT3与 p-STAT3在肿瘤中的表达一定程度上也表明了肿瘤细胞的侵袭转移程度[17]。本研究发现，经过卡托普利干预后，肿瘤组织中的STAT3以及p-STAT3表达均有降低且肿瘤细胞凋亡增加，说明卡托普利可能是通过对STAT3的调节来实现对肿瘤细胞凋亡的诱导或抑制其增殖。本实验研究表明，卡托普利对胃癌的治疗有较为明显的治疗效果，在对胃癌的临床治疗上可能具有一定可行性，但其临床可应用性需要进行进一步的研究。

Figure 4. Immunohistochemical results of the related factors (×200).

表1 相关因子阳性表达面积的比较

Figure 5. Expression of p-STAT3 and STAT3 proteins in diffe-rent groups.Mean±SD.n=15.*P<0.05 vs conrtol；#P<0.05 vs 5-Fu.

[参 考 文 献]

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