高粱中氮同位素丰度的测定和应用

钟其顶，武竹英，仇 凯，王道兵，程 涛，熊正河,，王 明，尹大宽，李 令

(1.中国食品发酵工业研究院，北京 100015；2.全国食品发酵标准化中心，北京 100015；3.国家固态酿造工程技术研究中心，四川 泸州 646000)

高粱是人类栽培的重要谷类作物和酿酒原料之一，在我国被广泛种植。随着人们对食品的健康和营养价值的重视，有机产品倍受欢迎，诸如有机白酒之类的高附加值的高粱产品也应运而生。然而，有机农业的产量低，总生产成本却较常规农业高[1]，在利益驱使下，一些不法种植者在种植过程中添加化肥或农药来提高产量或降低人工成本，采收后打着“有机产品”的幌子，以高于常规农产品几倍甚至十几倍的价格销售，这种行为严重损害了诚实的有机农产品种植者和食品企业的利益。

有机农产品与常规农产品最大的区别是在原料生长过程中不使用化肥和农药。我国现行的农药残留检测方法已经比较成熟，可以检测农产品表面或内部的微量农药残留；而对于是否使用化肥，尚无有效的检测方法。氮元素是植物中最主要的组成元素之一，主要来自于植物所用的肥料，不同来源的肥料，氮同位素组成不同，而施用不同氮肥也会导致植物的氮稳定同位素组成不同。国外已有研究证明，有机作物和常规作物的氮稳定同位素差异显著，氮同位素组成可作为鉴别有机和常规农产品的潜在指标[2]。

本工作通过设计有机肥组、化肥组、混合组、空白组4个实验组，分析肥料种类对高粱植株和果实中δ15N值的影响。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

元素分析-稳定同位素质谱联用仪(EA-IRMS)：美国Thermo-Fisher公司产品；烘箱：上海一恒科技有限公司产品。

1.2 主要材料与试剂

高粱果实为国窖红1号有机高粱；有机肥为市售商品有机肥；化学合成氮肥为市售尿素。

高粱种植于京郊某农场中，按施肥方式分为4组：有机肥组(仅施有机肥)、混合组(以纯氮计，有机肥、化肥各半)、化肥组(仅施化肥)和空白组(不施任何外源肥)，详细情况列于表1。各组所用有机肥和尿素的含氮量分别为2%和46%。除施肥种类不同外，其他管理条件均一致，并符合有机农业管理要求。待高粱成熟后，收集果实测定其氮同位素组成，每组取3个平行样品进行研磨测定。

表1 各组中肥料种类和施肥量Table 1 Fertilizer type and fertilization in different treatments

从泸州某有机高粱研究基地选4块土地种植高粱，任意两块之间间隔10 m以上，分别施加商品有机肥、农家肥、化肥和空白种植(不施任何外源肥)。并从泸州地区的大田中收集不同品种的有机和常规高粱果实，分别测定这些高粱果实中的氮同位素组成。

1.3 实验方法

1.3.1样品的前处理 将高粱果实于65 ℃下烘干至恒重，用粉碎机将其粉碎，再用研钵将其研磨成60目以下的粉末。植物样品的称样量要求其形成的N2离子流强度应在标准参考气的离子流强度线性范围之内，因此，需要根据不同植物样品中的氮含量以及被测气体进入IRMS 所产生的离子流强度大小来确定样品的称样量。根据以上原则，称取适量样品，用锡杯包好，待测。用锡杯包裹样品时，要排尽空气，避免空气中的氮气对样品测定造成干扰。经多次实验验证，高粱的取样量为3.00～5.00 mg时，信号强度符合要求。

1.3.2高粱的稳定同位素分析方法 EA-IRMS分析系统主要由3部分组成：配有自动进样器的Flash EA 2000 型元素分析仪；连续流接口装置ConfloⅣ；Thermo-Finnigan DELT Aplus XP 稳定同位素比率质谱仪。Flash 2000型元素分析仪由氧化炉、还原炉、吸水柱、分离柱等部分构成[3]。当用锡杯包裹的样品通过自动进样器送入氧化炉后，样品在过氧环境中瞬间高温分解，形成碳、氮、氧、硫各成分的混合气体在高纯氦气(纯度为99.999%) 的运载下依次通过还原炉、吸水柱和分离柱进入Conflo 装置。在此过程中，氮的各类氧化物在还原炉中被转化为N2，并通过色谱柱与其他气体分离， 经过ConfloⅣ整流后被送入质谱仪。以高纯氮气(纯度为99.999%) 作为参考标准， 测定样品的氮同位素比值[4]，整个分析系统的流程图示于图1。

图1 EA-IRMS 分析系统工作流程图Fig.1 Work process of EA-IRMS

1.4 结果表示

自然界稳定同位素常用丰度来描述，即同位素比值(R=重同位素/轻同位素)。由于稳定同位素的自然丰度极小，计算不方便，因此同位素丰度常通过另一个单位δ值来表达。δ值表示样品的同位素比值相对于标准样品同位素比值的千分偏差，其计算公式如下[5]：

δ15Nsample(‰) =

[(Rsample/Rstandard)-1] ×1 000

(1)

式中，Rsample为样品中15N与14N的比值；Rstandard为标准物质(空气氮库)中15N与14N的比值，15N/14N = 0.003 68。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的选择

通过多次实验，确定了载气条件、氧喷条件、参考气和进样量大小、EA系统温度等参数。最终优化的实验条件为：氧化炉温度980 ℃，还原炉温度650 ℃，炉温60 ℃，离子源真空1.8×10-4Pa，电压3.06 kV，进样量约4.00 mg。

2.2 北京地区不同种植组的高粱δ15N值

京郊实验田中各组高粱的δ15N值示于图2。由图2可见，有机肥组的高粱δ15N值显著高于化肥组样品，这主要是由于不同氮源的肥料施入所造成的。例如，大气氮的δ15N值约为0‰；土壤有机氮δ15N值大于大气氮，约为3‰[6-8]；化肥中氮δ15N值约为-2～0‰；而畜肥δ15N值约为10～20‰[9-11]。由于大气氮池是全球最大的氮池，经过了千万年的沉积，大气氮δ15N值不会在短时间内随时间或空间发生较大的变化[12]。化肥δ15N值接近于空气，是由于化学合成的氮肥中的氮来自于空气，而在化学合成过程中，同位素分馏较小，且14N较15N更容易反应，因此合成氮肥的氮同位素组成略低于空气[13-15]。 由于15N的富集，植物体内的15N丰度高于空气中的，当作物被再利用时(如沤肥、作为动物饲料)，15N会进一步发生富集[16]。本研究中，不同肥料的施入导致不同的氮源被植物吸收，造成植物δ15N值差异。

图2 北京地区不同种植组的高粱δ15N值Fig.2 δ15N values of sorghum in different treatments in Beijing

不同种植组中，有机肥组的高粱δ15N 值和对应的空白组样品的δ15N 值差异较小，这是由于在缺氮情况下，植物对氮的吸收机制与氮源充足时不同，此时的植物更容易富集15N。巨晓棠等[17]研究发现，在低施氮量时，植物吸收的氮素以NO3-形式存在较少，而以NH4+形式存在较多；Choi等[18]研究发现，样品中铵态氮(NH4+-N)的δ15N值比硝态氮 (NO3--N)的δ15N值高；由这两个结果可以推断出空白组样品的δ15N值会较高，这与本研究的结果相吻合。不施任何肥料的作物也属于有机作物，因此，空白组样品可以认为是有机样品，不会干扰到有机样品和常规样品的区分。

2.3 泸州地区不同品种和种植方式的高粱δ15N值

收集泸州地区的不同高粱样品进行δ15N值的测定。样品1为商品有机肥组，样品2为农家肥组，样品3为化肥组，样品4为空白组，样品5、6分别为泸州两个不同地区的大田生产的国窖红1号高粱果实，样品7、8为在泸州地区收集到的与国窖红1号品种不同的两个常规高粱果实。每个样品做3次重复实验，测定结果示于图3。

图3 泸州地区不同品种和种植方式的高粱果实δ15N值Fig.3 δ15N values of sorghum in different treatments or varieties in Luzhou

空白组高粱果实δ15N值略低于有机肥组，这是由于空白组氮源不足，吸收机制与其他种植组样品不同，同时说明样品δ15N值与含氮量的关系不大。与京郊实验田中的样品相同，泸州国窖红1号样品中，有机肥组(包括商品有机肥组和农家肥组)和空白组的高粱果实δ15N值均高于化肥组。大田中收集的有机高粱样品5的δ15N值略低于其他有机样品，这可能是由于所用的肥料为植物秸秆类有机肥，其本身的δ15N值偏低。样品3、样品7和样品8虽然同为施化肥样品，但δ15N值差异较大，可能是由肥料差异和作物品种差异所造成的。Yoneyama等[19]分别对3种不同品种的甜薯和甜高粱进行研究，发现同种作物不同品种间的差异很小，由此可排除品种差异。那么，可能的原因是样品7和样品8是在常规种植区域采集的样品，常规种植区长期使用化肥；而样品3的种植地是在泸州有机高粱研究区域开辟出来的实验田，该区域以往几年均种植有机高粱，土壤中有多余的未被植物吸收的残留有机肥，在样品生长过程中会逐渐释放肥效。因此，样品3的δ15N值会明显高于样品7和样品8。

不论是京郊实验田的样品还是泸州地区的样品，不论品种是否相同，本研究中所有施化肥的样品δ15N值均低于施有机肥的样品δ15N值，尤其对于同种植物来说，有机样品和常规样品δ15N值差异更明显。因此，在有机监管过程中，δ15N值检测虽然不能替代其他检测，但可以作为追踪植物施肥情况的一个重要参考要素。

3 结论

本研究通过对有机和常规高粱果实进行稳定氮同位素分析，发现使用不同肥料的植物δ15N值明显不同，有机高粱样品的δ15N值均高于常规样品，因此，高粱δ15N值可以作为判断高粱生长过程中施肥情况的参考要素，尤其是对同一品种的农作物，δ15N值的参考性更强。所建立的稳定同位素技术对施肥方式的判断方法，填补了我国从农产品追踪植物施肥情况的技术空白，可以作为完善有机农产品认证的市场监管技术手段；结合有机高粱同位素数据库的建立，也可为有机白酒和其他高粱酿造的白酒的原料质量控制提供技术支撑。

致谢：感谢泸州老窖股份有限公司在样品的种植和收集方面给予的帮助。

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