离线平衡法与GC-IRMS联用测定水中δ18O

王道兵，钟其顶，刘 明，刘传贺，黄占斌

(1. 中国矿业大学(北京)，化学与环境工程学院，北京 100083；2. 中国食品发酵工业研究院，北京 100027；3. 全国食品发酵标准化中心，北京 100027)

水是自然界分布最广泛的物质，受稳定同位素热动力分馏作用的影响，不同条件下的水中16O和18O含量具有一定差异。根据水中氧稳定同位素(δ18O)的自然分布特征，可揭示地球水循环过程中的潜在规律，为生态环境治理提供科学依据；也可利用自然水体和植物水分的同位素差异鉴别食品的真伪[1-7]。

目前，测定水中δ18O的方法主要有H2O-CO2同位素交换平衡法[8]和高温裂解法[9-11]。其中，高温裂解法是近几年发展起来的，该方法分析速度快，但分析精度比经典的双路测定法略差[12]，而且只能测定纯水样品。H2O-CO2同位素交换平衡法是应用最早，也是最经典的测定含水样品水中δ18O的方法，基于此方法的分析技术主要有2种[13]：传统的离线-双路进样稳定同位素比值质谱技术(off line-dual inlet-IRMS)和在线平衡分析技术[14](GasBench-IRMS)。其中，离线处理-双路进样测定是应用最早的分析技术，具有较高的分析精度和准确度，但实验过程较长，操作步骤繁琐，对实验人员的要求较高；GasBench-IRMS技术操作简单，适用于大量样品的连续测定，但该装置比较昂贵。气相色谱-稳定同位素比值质谱(GC-IRMS)技术是近年来开发的一种可在线、连续分析有机化合物的碳、氢、氧、氮同位素组成的方法，在代谢流研究、特征化合物同位素组成分析和食品真实性鉴别等领域具有重要应用[15-21]。

本工作根据H2O-CO2同位素交换原理及GC-IRMS分析样品的特点，建立离线平衡与GC-IRMS联用测定样品水中δ18O的方法，研究进样体系和反应体系的稳定性，并对反应条件进行优化。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

气相色谱-稳定同位素比值质谱仪：美国Thermo-Fisher公司产品，配有Triplus自动进样器(带54位样品盘和气密进样针)及Isodat 3.0数据处理系统；恒温振荡水浴锅：北京中慧天诚科技有限公司产品；充气装置：实验室自制，结构示于图1; 20 mL顶空样品瓶(作为反应瓶)；极性毛细管色谱柱。

注：1. CO2钢瓶; 2. 减压阀; 3. Ф 1/8"不锈钢管; 4. 进气歧管; 5. 硅胶管; 6. Ф 6 mm不锈钢毛细管图1 充气装置Fig.1 Schematic diagram of an aeration system sturcture

1.2 主要材料与试剂

氦气、二氧化碳气体(纯度≥99.999%)：由北温气体厂提供；电解铜丝、炭黑：美国Thermo-Fisher公司产品。

1.3 实验条件

1.3.1实验方法 取3.0 mL含水样品加入反应瓶中，放入0.6 mg电解铜丝和6 mg炭黑，通过充气装置向反应瓶中充入CO2气体，并置换瓶中的空气，整个过程持续10 min；将反应瓶置于恒温振荡水浴锅中，使瓶内样品水与CO2进行氧同位素交换，反应时间8～24 h。

1.3.2GC-IRMS条件 任意极性色谱柱，进样口温度100 ℃，柱温100 ℃，分流比为30∶1。用气密进样针取4 μL平衡后的CO2气体，注入气相色谱仪中，每个样品连续采样10次，并进样测定，取后6次测定结果的平均值作为该样品的δ18O(‰)。

1.4 数据校正

样品测定过程中插入质控水样和标准水样，依据Stephen等[19]报道的VSMOW/SLAP校正法进行校正。

2 结果与讨论

采用离线平衡法与GC-IRMS技术联用测定样品水中δ18O时，进样系统的稳定性和记忆效应、充气装置稳定性、反应瓶气密性、平衡时间和样品体积等均可能影响测定结果的有效性。本工作对这些因素进行了逐一考察和优化(以在线平衡分析技术GasBench II-IRMS的测定精度0.15‰为评判基准)。

2.1 进样系统稳定性

精密度是稳定同位素比值质谱测定数据有效性的基础指标。离线平衡法与GC-IRMS技术联用测定样品水中δ18O时，平衡后的CO2经气密进样针采集后，注入气相色谱仪中分离、纯化，然后再进入离子源进行测定，连续10次进样并测定，得出的平均值作为该CO2气体的δ18O测定结果，其离子流色谱图示于图2，测定的精密度列于表1。

从图2和表1可以看出，连续10次进样的信号强度几乎一致，有效避免了在连续流装置分析过程中，因离子流强度差异而产生的系统偏差[22]；连续10次测定CO2中δ18O值的标准偏差仅为0.04‰，该结果达到了在线平衡分析技术GasBench II-IRMS的分析精度要求(0.08‰)。

图2 GC-IRMS测定CO2中δ18O的离子流图Fig.2 Ion current of δ18O of CO2 measured by GC-IRMS

表1 GC-IRMS测定CO2中δ18O的精密度Table 1 Inter-precision of δ18O of CO2 measured by GC-IRMS

2.2 进样系统记忆效应

采用稳定同位素比值质谱仪分析样品时，应防止已测样品对待测样品的干扰，即避免记忆效应。为规避记忆效应，双路进样系统通过真空泵将样品仓抽空后再引入新样品[23]，在采集新样品时，采用在线平衡分析技术(GasBench-IRMS)，通过载气吹扫采集装置以消除上一样品的残留[24-25]。而用离线平衡法与GC-IRMS联用技术测定水中δ18O时，采用气密进样针进样，采集新样品时既不能抽真空，也无法用载气吹扫，更不能用有机溶剂清洗[26]。为验证该步骤是否存在记忆效应，选取2个δ18O差异较大的CO2气体(样品A和B)，连续10次进样，测定A后连续10次测定B，然后再测A，再测B，依次交替测定。尽管2个样品的δ18O差异大于20‰，但交替测定过程中未发生相互干扰的现象，结果示于图3。这说明该进样体系不会产生记忆效应。

图3 GC-IRMS进样系统记忆效应验证Fig.3 Memory effects test of inlet system of GC-IRMS

2.3 充气装置稳定性

应用离线平衡与GC-IRMS联用技术测定水中δ18O时，为保证测定连续性，需同时向多个反应瓶中充入CO2，以便与样品水反应。为验证充气装置的稳定性，任意选择充气装置中的充气位点分析充气均一性，固定选择某充气位点验证充气重复性，结果列于表2和表3。结果表明，同时充气时，各位点的CO2水中δ18O是相同的，即该充气装置的均一性良好，且充气重复性也很理想。这为在实际工作中进行质量控制提供了方便。

表2 充气均一性实验结果Table 2 The results of homogeneity of CO2 aeration

表3 充气重复性实验结果Table 3 The results of repeatability of CO2 aeration

2.4 反应瓶气密性

采用同位素平衡交换法分析水中氧同位素组成，水与CO2在反应瓶内发生氧同位素交换反应时需要一定的时间，而测定也需要一定的时间。因此，同批次充气、平衡的样品会有不同的待测间隔，所以需保证反应瓶的气密性在样品气体平衡、待分析过程中不发生变化。本研究采用的反应瓶由顶空瓶、铝盖和垫片3部分组成，垫片的优劣决定了反应瓶的气密性。本工作考察了4种市售垫片的密封性，结果示于图4。

注：◆垫片A；■垫片B；▲垫片C；×垫片D图4 反应瓶气密性实验Fig.4 Bottle seal gasket selection

通过充气装置向顶空瓶中导入CO2，同时排出瓶内空气，分别用A、B、C、D 4种垫片密封。由图4可知，垫片B和C在8 h后出现同位素变化，且呈现偏正的趋势，这是由于垫片密封性不理想而发生气体渗漏所致；垫片A的密封性能较好，但实验中发现该垫片太厚，容易损坏进样针；使用垫片D时，CO2气体中δ18O在0～24 h内差异变化很小(小于测定误差0.15‰)。因此选择垫片D用作后续研究。

2.5 平衡时间的选择

由于实验选择的垫片D的气密性仅能保证24 h，而静置时的同位素交换反应达到平衡至少需要12 h，为尽可能多的分析样品，本研究选择振荡处理以促进氧同位素交换。结果表明，振荡处理时仅需8 h即可达到同位素平衡状态，结果示于图5。

2.6 样品体积的影响

有研究报道，GasBench-IRMS技术测定水中δ18O的结果会因样品体积不同而有差异[14]。为验证样品体积对离线平衡法与GC-IRMS联用技术的影响，本研究对样品体积在2～5 mL变化时的测定情况进行了探讨，结果列于表4。

实验结果表明，当样品体积在2～5 mL时，5次测定结果的平均值比较接近，但是样品体积在2、4、5 mL时，不如在3 mL时稳定。由此，应用该技术时，推荐样品体积为3 mL。

图5 振荡处理时，同位素交换平衡时间Fig.5 Isotopic exchange equilibration time under osciuating conditions

表4 样品体积对水中δ18O测定的影响 (n=5)Table 4 Effect of sample volume on δ18O-value of water

2.7 与GasBench II-IRMS法对比分析

为探讨本方法的适用范围，选取了3个纯净水、3个葡萄酒和2个果汁样品，同时用离线平衡与GC-IRMS联用技术和GasBench II-IRMS法分别进行分析，原始数据的对比结果示于图6。结果表明，两种技术所测得的结果呈良好的线性正相关(R2=0.999 8)。这说明本实验建立的方法与GasBench II-IRMS具有同等分析能力，根据GasBench II-IRMS的校正法则[27]，可以准确得出以SMOW为基准的样品水中δ18O值。

图6 两种分析技术的结果对比Fig.6 Comparision of analysis results with GC-IRMS and GasBench Ⅱ-IRMS

2.8 准确性验证

为考察本方法的准确性，先后4次采用本方法参加欧洲实验室能力验证项目(FIT-PTS)，并选择其中6个盲样进行比对分析，测定结果及统计数据列于表5。使用本方法得出的结果与欧盟众实验室的平均值差异均在0.35‰之内，且最小差异仅有0.03。经计算标准得分，说明本方法的数据符合统计要求，即能够测定不同水样品中δ18OSMOW。

表5 测定水中δ18OSMOW的实验室能力验证结果Table 5 The results of δ18OSMOW and experimental data for inter-laboratory comparison

注：标准得分Z=(χ-μ)/σ

3 结论

本工作建立了基于H2O-CO2同位素交换平衡原理分析水中δ18O的离线平衡法与GC-IRMS联用技术，通过自制充气系统充入CO2气体，在恒温水浴锅中振荡反应后，用气密进样针采集样品，经GC分离、纯化后，由IRMS测定，进样系统不存在记忆效应，反应时间短，反应瓶的气密性在24 h内可靠，测定结果准确。该技术配套设施简单、操作方便、成本低廉，拓展了GC-IRMS的功能，是一种可在有限条件下替代传统的离线平衡-双路测定法和GasBench-IRMS的技术。

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